本文關(guān)鍵詞：煙粉虱唾液腺和卵巢在傳播雙生病毒中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：雙生病毒科(Geminiviridae)是植物病毒中的第二大科,也是唯一一類具有孿生顆粒形態(tài)和單鏈環(huán)狀DNA基因組的病毒,可在番茄、棉花和木薯等多種經(jīng)濟(jì)作物上引起毀滅性的危害。雙生病毒主要的傳播介體是煙粉虱Bemisia tabaci,通常煙粉虱種群的暴發(fā)往往伴隨著雙生病毒病的流行。探索煙粉虱如何傳播雙生病毒,有助于揭示雙生病毒病流行的過程及機(jī)理。本文以兩種入侵性極強(qiáng)的Middle East Asia Minor 1 (MEAM1)和Mediterranean (MED)煙粉虱為研究對(duì)象,研究了兩種雙生病毒番茄黃曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)和中國(guó)番茄黃曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)經(jīng)由這兩種煙粉虱傳播的生理和分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：(1) TYLCV在MEAM1煙粉虱中腸、卵巢以及唾液腺的分布通過免疫熒光技術(shù)在MEAM1煙粉虱中腸定位TYLCV外殼蛋白(coat protein, CP)發(fā)現(xiàn),TYLCV信號(hào)在中腸分布較廣,而且在濾室部位富集。在卵巢中定位病毒發(fā)現(xiàn),病毒主要在分布在煙粉虱成熟的卵子中,而未成熟的卵巢管中未見病毒分布；在唾液腺中定位病毒發(fā)現(xiàn),病毒主要分布在唾液腺中間區(qū)域的幾個(gè)細(xì)胞,其他區(qū)域僅見少量病毒信號(hào)。以上結(jié)果明確了TYLCV在煙粉虱這三個(gè)重要器官中的分布情況。(2) MEAM1和MED煙粉虱特異性傳播TYLCV和TYLCCNV的機(jī)制通過傳毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MEAM1可以傳播TYLCV和TYLCCNV,而MED僅可以傳播TYLCV,不能傳播TYLCCNV。比較MEAM1和MED煙粉虱對(duì)TYLCCNV的獲取和存留能力發(fā)現(xiàn),MED獲取和存留TYLCCNV的能力甚至強(qiáng)于MEAM1,說明二者獲取和存留病毒能力的差異并不是導(dǎo)致MED不能傳播TYLCCNV的原因。通過檢測(cè)MED體內(nèi)是否存在TYLCCNV循環(huán)的屏障,發(fā)現(xiàn)病毒能以較低的效率進(jìn)入MED的唾液腺但是不能隨唾液分泌出來。為了研究病毒CP是否也參與了MED特異性地傳播TYLCV和TYLCCNV,將TYLCV與TYLCCNV的CP氨基酸序列中差異較大的部分進(jìn)行了互換,發(fā)現(xiàn)重組CP后的TYLCCNV變得可以被MED傳播,而重組CP后的TYLCV則變得幾乎不能被MED傳播。煙粉虱唾液腺也參與了這兩種重組病毒的特異性傳播。觀察TYLCV和TYLCCNV在MED煙粉虱唾液腺內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn),TYLCV在煙粉虱獲毒的初始3-12 h內(nèi),分布于整個(gè)唾液腺,獲毒12-24 h之間,病毒逐漸集聚在唾液腺的中間區(qū)域。獲毒36-72 h后,TYLCV僅分布于唾液腺中間沿唾管分布的細(xì)胞,病毒在唾液腺其它部位分布極少。而TYLCCNV在MED煙粉虱獲毒的初始4-12 h內(nèi),僅有少量病毒信號(hào)分布于唾液腺的邊緣,獲毒24-72h之后,病毒逐漸消失。這兩種病毒在MEAM1煙粉虱唾液腺內(nèi)的運(yùn)動(dòng)動(dòng)態(tài)與TYLCV在MED唾液腺中的類似。以上結(jié)果表明了煙粉虱的唾液腺和雙生病毒的CP共同決定了病毒傳播的特異性。(3) MEAM1和MED垂直傳播TYLCV的生理和分子機(jī)制免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)TYLCV僅進(jìn)入MEAM1煙粉虱成熟的卵子,推測(cè)TYLCV垂直傳播的效率可能與煙粉虱卵巢的發(fā)育成熟度有關(guān)。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)發(fā)育成熟的煙粉虱卵巢中的病毒含量顯著高于未成熟的卵巢。隨著煙粉虱日齡的增加,其垂直傳播TYLCV的效率也顯著增加,而且經(jīng)垂直傳播獲毒的F1代成蟲也能侵染健康的植物。煙粉虱卵巢的發(fā)育成熟度與卵黃原蛋白(vitellogenin, Vg)密切相關(guān),Vg基因在羽化5天之內(nèi)的煙粉虱體內(nèi)的表達(dá)量都維持在一個(gè)很低的水平,在羽化11d左右會(huì)逐漸達(dá)到最高水平。免疫定位Vg和TYLCV CP在MEAM1和MED煙粉虱卵巢中的分布發(fā)現(xiàn)二者是完全共定位的。分別用TYLCV CP和Vg的單克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),CP抗體可以將攜毒煙粉虱總蛋白中的Vg沉淀下來,Vg抗體也可以將攜毒煙粉虱總蛋白中的TYLCV CP沉淀下來,說明二者在煙粉虱體內(nèi)互作。通過飼喂煙粉虱Vg的抗體方法阻礙病毒與Vg結(jié)合,發(fā)現(xiàn)飼喂抗體后,病毒垂直傳播的效率降低。以上結(jié)果表明TYLCV垂直傳播的效率與煙粉虱的卵巢發(fā)育進(jìn)程有關(guān),煙粉虱的卵黃原蛋白Vg可以幫助TYLCV垂直傳播至下一代。綜上所述,本研究闡明了兩種病毒在煙粉虱體內(nèi)的分布情況,揭示了兩種病毒經(jīng)由煙粉虱MEAM1和MED隱種特異性傳播以及經(jīng)卵垂直傳播的重要生理和分子機(jī)制。這些研究結(jié)果加深了對(duì)煙粉虱傳播雙生病毒機(jī)制的認(rèn)識(shí),為進(jìn)一步揭示煙粉虱傳雙生病毒的分子機(jī)制、研發(fā)阻礙煙粉虱傳毒的新方法提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：煙粉虱 番茄黃曲葉病毒 中國(guó)番茄黃曲葉病毒 煙粉虱-雙生病毒互作 外殼蛋白 垂直傳播 唾液腺 卵巢
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S432.41;S433
【目錄】：

• 致謝7-11
• 摘要11-13
• Abstract13-21
• 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究目的21-40
• 1.1 煙粉虱21-22
• 1.1.1 煙粉虱概述21-22
• 1.1.2 煙粉虱的危害現(xiàn)狀22
• 1.2 雙生病毒概述及其危害22-27
• 1.2.1 雙生病毒科的分類、寄主范圍及介體傳播22-24
• 1.2.2 雙生病毒(菜豆金黃花葉病毒屬)的基因組結(jié)構(gòu)和功能24-26
• 1.2.3 雙生病毒危害26-27
• 1.3 雙生病毒與介體昆蟲的互作27-35
• 1.3.1 介體昆蟲傳播植物病毒的方式27-28
• 1.3.2 雙生病毒由煙粉虱經(jīng)卵和交配傳播28-29
• 1.3.3 煙粉虱傳播雙生病毒的特異性及其機(jī)制29-31
• 1.3.3.1 煙粉虱傳播雙生病毒的特異性29
• 1.3.3.2 影響煙粉虱特異性傳播雙生病毒的器官29-30
• 1.3.3.3 參與病毒循環(huán)傳播的煙粉虱蛋白30
• 1.3.3.4 雙生病毒的外殼蛋白30-31
• 1.3.4 內(nèi)共生細(xì)菌對(duì)煙粉虱傳毒的影響31-32
• 1.3.5 雙生病毒對(duì)煙粉虱的直接影響32-35
• 1.3.5.1 雙生病毒對(duì)煙粉虱存活和產(chǎn)卵的影響32-33
• 1.3.5.2 雙生病毒對(duì)煙粉虱取食行為的影響33-34
• 1.3.5.3 雙生病毒侵染對(duì)煙粉虱基因表達(dá)的影響34-35
• 1.4 植物介導(dǎo)的雙生病毒與煙粉虱互作35-38
• 1.4.1 植物介導(dǎo)的雙生病毒-煙粉虱互作的多樣性35-36
• 1.4.2 植物介導(dǎo)的雙生病毒-煙粉虱互作的生理和分子機(jī)制36-38
• 1.5 本研究目的與主要內(nèi)容38-40
• 1.5.1 本研究目的38-39
• 1.5.2 研究?jī)?nèi)容39-40
• 第二章 基本材料和方法40-59
• 2.1 基本材料40-44
• 2.1.1 供試?yán)ハx40
• 2.1.2 供試植物40-41
• 2.1.3 供試病毒41
• 2.1.4 感毒植物的獲取41
• 2.1.5 生態(tài)學(xué)相關(guān)儀器設(shè)備41-42
• 2.1.6 分子生物學(xué)主要儀器設(shè)備42-43
• 2.1.7 分子生物學(xué)常用試劑43-44
• 2.2 基本實(shí)驗(yàn)方法44-59
• 2.2.1 煙粉虱隱種鑒定方法(RFLP-PCR)44-48
• 2.2.1.1 煙粉虱總DNA的提取44
• 2.2.1.2 PCR反應(yīng)體系(20μL/份)44
• 2.2.1.3 PCR反應(yīng)條件44-45
• 2.2.1.4 TaqI酶切PCR產(chǎn)物45
• 2.2.1.5 PCR產(chǎn)物的純化、克隆及單菌落測(cè)序45-48
• 2.2.1.5.1 PCR產(chǎn)物的純化45-46
• 2.2.1.5.2 PCR純化產(chǎn)物連接46
• 2.2.1.5.3 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備46
• 2.2.1.5.4 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化46-47
• 2.2.1.5.5 測(cè)序47
• 2.2.1.5.6 堿裂解法小量提取大腸桿菌質(zhì)粒47-48
• 2.2.2 重疊延伸PCR技術(shù)48-49
• 2.2.3 重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌及植物接種49-50
• 2.2.3.1 根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備49
• 2.2.3.2 重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌49-50
• 2.2.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物接種50
• 2.2.4 感毒植物和攜毒煙粉虱的鑒定50-51
• 2.2.4.1 植物基因組和攜毒煙粉虱總DNA的提取50
• 2.2.4.2 PCR檢測(cè)植物和煙粉虱體內(nèi)的病毒DNA50-51
• 2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技術(shù)51-54
• 2.2.5.1 煙粉虱總RNA提取51-53
• 2.2.5.2 煙粉虱cDNA合成53
• 2.2.5.3 qPCR體系53-54
• 2.2.5.4 (RT)qPCR數(shù)據(jù)分析54
• 2.2.6 Western雜交(Western Blot,WB)54-56
• 2.2.6.1 煙粉虱總蛋白的提取54-55
• 2.2.6.2 蛋白濃度測(cè)定55
• 2.2.6.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)55
• 2.2.6.4 電轉(zhuǎn)移55-56
• 2.2.6.5 Western印跡分析56
• 2.2.7 Light microscopy(LM)56-57
• 2.2.8 熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization,FISH)57
• 2.2.9 免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence,IF)57-59
• 第三章 雙生病毒在煙粉虱體內(nèi)的分布59-67
• 3.1 基本材料60-61
• 3.1.1 供試?yán)ハx、植物和病毒60
• 3.1.2 主要試劑和抗體60-61
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法61
• 3.2.1 MEAM1獲取TYLCV61
• 3.2.2 煙粉虱器官的解剖與收集61
• 3.2.3 免疫熒光定位61
• 3.3 結(jié)果與分析61-65
• 3.3.1 煙粉虱唾液腺、中腸及卵巢形態(tài)特征61-63
• 3.3.2 TYLCV在煙粉虱中腸的分布63
• 3.3.3 TYLCV在煙粉虱卵巢的分布63-64
• 3.3.4 TYLCV在煙粉虱唾液腺的分布64-65
• 3.4 討論65-67
• 第四章 煙粉虱特異性傳播TYLCV及TYLCCNV的生理和分子機(jī)制67-92
• 4.1 基本材料68
• 4.1.1 供試?yán)ハx、植物和病毒68
• 4.1.2 主要試劑68
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法68-74
• 4.2.1 雙生病毒經(jīng)MEAM1或MED煙粉虱傳播能力的檢測(cè)68-69
• 4.2.2 煙粉虱獲取和存留TYLCCNV能力的檢測(cè)69
• 4.2.3 PCR檢測(cè)雙生病毒在煙粉虱各個(gè)組織及唾液中的分布69
• 4.2.4 FISH檢測(cè)雙生病毒在煙粉虱中腸及唾液腺的分布69-70
• 4.2.5 TYLCV和TYLCCNV CP互換的重組病毒的載體構(gòu)建70-74
• 4.2.6 雙生病毒在煙粉虱唾液腺內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化74
• 4.3 結(jié)果與分析74-89
• 4.3.1 煙粉虱不同隱種傳播TYLCV及TYLCCNV的能力74
• 4.3.2 煙粉虱獲取和存留TYLCCNV能力的比較74-76
• 4.3.3 TYLCCNV在煙粉虱各個(gè)組織及唾液的分布76-79
• 4.3.4 煙粉虱不同隱種傳播重組病毒的能力79-80
• 4.3.5 重組病毒在煙粉虱體內(nèi)的存留80-83
• 4.3.6 雙生病毒在煙粉虱唾液腺的動(dòng)態(tài)變化83-89
• 4.4 討論89-92
• 第五章 煙粉虱垂直傳播TYLCV的生理及分子機(jī)制的初步探索92-113
• 5.1 基本材料92-93
• 5.1.1 供試?yán)ハx、植物和病毒92-93
• 5.1.2 主要試劑93
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法93-98
• 5.2.1 IF檢測(cè)TYLCV在煙粉虱卵巢的分布93
• 5.2.2 qPCR檢測(cè)TYLCV在煙粉虱不同發(fā)育階段的蟲體及卵巢中的相對(duì)量93
• 5.2.3 檢測(cè)不同發(fā)育階煙粉虱經(jīng)卵傳播TYLCV的能力93-94
• 5.2.4 攜帶TYLCV的煙粉虱子代成蟲侵染植物能力檢測(cè)94-95
• 5.2.5 qPCR檢測(cè)Vg在煙粉虱不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量95
• 5.2.6 IF共定位TYLCV和Vg在煙粉虱卵巢的分布95
• 5.2.7 TYLCV CP和Vg的體外互作95-97
• 5.2.8 飼喂煙粉虱Vg抗體對(duì)其F1代卵的帶毒率的影響97-98
• 5.3 結(jié)果與分析98-110
• 5.3.1 免疫熒光定位TYLCV在MEAM1煙粉虱卵巢的分布98-99
• 5.3.2 TYLCV在煙粉虱不同發(fā)育階段的蟲體及卵巢中的相對(duì)含量99-100
• 5.3.3 TYLCV經(jīng)由不同發(fā)育階段煙粉虱垂直傳播的特性100-101
• 5.3.4 攜帶TYLCV的煙粉虱子代成蟲侵染植物能力檢測(cè)101-102
• 5.3.5 qPCR檢測(cè)Vg在煙粉虱不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量102-103
• 5.3.6 免疫熒光共定位TYLCV和Vg在煙粉虱卵巢的分布103-106
• 5.3.7 免疫共沉淀檢測(cè)TYLCV CP和Vg的體內(nèi)互作106-108
• 5.3.8 飼喂煙粉虱Vg抗體后對(duì)其垂直傳播病毒能力的影響108-110
• 5.4 討論110-113
• 第六章 總討論113-120
• 6.1 本研究的特色和創(chuàng)新之處116
• 6.2 本研究存在的問題116-117
• 6.3 值得繼續(xù)研究的問題117-120
• 參考文獻(xiàn)120-130

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：煙粉虱唾液腺和卵巢在傳播雙生病毒中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：297710