本文關(guān)鍵詞：油菜和擬南芥中幾個(gè)硫代葡萄糖苷合成及調(diào)控基因的功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：為了適應(yīng)復(fù)雜的生存環(huán)境,植物在長期的進(jìn)化過程中產(chǎn)生了種類繁多且功能各異的代謝產(chǎn)物,以應(yīng)對時(shí)刻變化的外界因素以及各種脅迫。硫代葡萄糖苷(簡稱硫苷)是白花菜目植物所特有的一類含硫、氮的重要次生代謝產(chǎn)物。近年來硫苷的代謝途徑被稱作研究次生代謝產(chǎn)物的 模式系統(tǒng)‖,硫苷在植株防御、硫元素的調(diào)節(jié)以及人類預(yù)防多種疾病等方面都發(fā)揮著重要的作用。多種多樣的脅迫促使植物體內(nèi)產(chǎn)生了多種功能各異的硫苷,而且硫苷還很容易受到其它防御化合物的誘導(dǎo),這些都導(dǎo)致硫苷的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其硫苷調(diào)控機(jī)制的研究十分復(fù)雜。與擬南芥擁有共同祖先的重要的油料作物油菜由于其異源四倍體基因組的復(fù)雜性,硫苷代謝的研究目前還不夠深入,一定程度上影響了硫苷的防御功能在油菜中的應(yīng)用。為了深入了解硫苷調(diào)控及其生物學(xué)功能,我們開展了以下三個(gè)方面的研究:1)利用共表達(dá)分析擬南芥中新進(jìn)化來的苯甲酰氧基硫苷代謝途徑的相關(guān)基因,鑒定并驗(yàn)證了兩個(gè)保守的轉(zhuǎn)錄因子MYB115和MYB118可以調(diào)控硫苷代謝的相關(guān)基因的表達(dá);2)分析了甘藍(lán)型油菜中三個(gè)硫苷合成途徑上的基因Bn MAM1、Bn CYP83A1和Bn UGT74B1在硫苷代謝途徑中的功能和作用;3)將這三個(gè)基因在甘藍(lán)型油菜中過表達(dá)后探索轉(zhuǎn)基因植株葉片的抗菌核病和灰霉病的能力。主要研究結(jié)果如下:1、通過對擬南芥中新進(jìn)化的種子特異的苯甲酰氧基硫苷代謝的相關(guān)基因(AOP3、BZO1和SCPL17)共表達(dá)分析,鑒定到兩個(gè)可能調(diào)控硫苷代謝的保守的轉(zhuǎn)錄因子MYB115和MYB118。與硫苷合成代謝相關(guān)基因的酵母單雜交驗(yàn)證和基因表達(dá)分析表明,這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與擬南芥硫苷的代謝調(diào)控。對MYB115和MYB118單基因缺失突變體的種子、葉片和花器官中硫苷含量分析發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的突變導(dǎo)致種子中與AOP3和BZO1相關(guān)的亞磺�；�、羥基類和苯甲酰氧基類硫苷均發(fā)生了顯著地變化;雖然MYB115和MYB118在葉片中僅有極微量的表達(dá),但這些器官中的脂肪族硫苷均有不同程度的改變;在myb115和myb118突變體的所有的花器官中短鏈的亞磺�；惲蜍站酗@著地提高,而所有種子、葉片和花器官中的吲哚族硫苷的含量和野生型對照相比均無顯著的差異。功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明,引入野生型基因到突變體后上述目標(biāo)性狀均能恢復(fù)到野生型水平,進(jìn)一步說明了這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與了多個(gè)器官的硫苷代謝調(diào)控。2、通過檢測MYB115和MYB118雙突變體的種子中硫苷含量,結(jié)合單、雙突變體中相關(guān)基因的表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對于調(diào)控部分脂肪族硫苷是功能冗余的且存在上位互作效應(yīng)。此外,MYB115和MYB118以不同的互作模式調(diào)控了苯甲酰氧基硫苷代謝相關(guān)基因AOP3和BZO1的表達(dá):myb118aop3雙突變體中相對于各個(gè)單突變體,它的4-亞磺酰丁基硫苷含量顯著增加但與其相對應(yīng)的4-甲硫丁基硫苷并沒有提高;在myb115aop3雙突變體中4-甲硫丁基硫苷的含量卻增加了;雙突變體myb118bzo1積累了大量的短鏈羥基類硫苷,同時(shí)它的底物甲硫烷基類硫苷和亞磺�；惲蜍沼兄煌潭葴p少,但myb115bzo1和單突變體bzo1的各種硫苷含量僅有微小的差別。上述結(jié)果說明了MYB115和MYB118是兩個(gè)保守的轉(zhuǎn)錄因子且調(diào)控了擬南芥中新進(jìn)化的苯甲酰氧基硫苷代謝,我們因此推斷出新進(jìn)化的代謝途徑也可以被保守的調(diào)控因子所調(diào)控,并不一定需要重新進(jìn)化新的調(diào)控因子,這一結(jié)論進(jìn)一步完善了新進(jìn)化基因的調(diào)控模型。3、我們分別克隆了甘藍(lán)型油菜中脂肪族硫苷合成途徑上的兩個(gè)基因Bn MAM1和Bn CYP83A1,以及參與了脂肪族硫苷和吲哚族硫苷合成途徑上的一個(gè)基因Bn UGT74B1。通過油菜接種病菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Bn MAM1和Bn CYP83A1參與了對核盤菌的入侵的早期響應(yīng),而Bn UGT74B1在核盤菌侵染的整個(gè)時(shí)期均有比較高的誘導(dǎo)表達(dá);與菌核病的響應(yīng)不同的是Bn MAM1和Bn CYP83A1在灰霉菌入侵過程中的表達(dá)水平持續(xù)降低,而Bn UGT74B1在全過程都有比較高的誘導(dǎo)表達(dá)。這些結(jié)果說明了甘藍(lán)型油菜在應(yīng)對這兩種死體營養(yǎng)型病菌入侵時(shí)脂肪族硫苷和吲哚族硫苷的響應(yīng)模式可能是不同的。與野生型對照相比,在甘藍(lán)型油菜過表達(dá)上述三個(gè)基因后,轉(zhuǎn)基因油菜葉片部分脂肪族硫苷含量有所提高(2OH3B GLS和3-Butenyl GLS),過表達(dá)Bn UGT74B1還導(dǎo)致葉片吲哚族硫苷(I3M GLS)含量顯著提高,這些結(jié)果進(jìn)一步闡述了Bn MAM1,Bn CYP83A1和Bn UGT74B1在甘藍(lán)型油菜的硫苷代謝途徑中的相應(yīng)的功能。4、分別在三個(gè)過表達(dá)基因的甘藍(lán)型油菜葉片接種核盤菌和灰霉菌,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Bn UGT74B1的植株葉片接種核盤菌16 h時(shí)和接種灰霉菌32 h的發(fā)病率均在12%之內(nèi),而野生型對照接種這兩種病相同時(shí)期的發(fā)病率都在90%以上,而且過表達(dá)Bn UGT74B1的植株葉片接種核盤菌48h時(shí)和接種灰霉菌76 h的病斑面積也都顯著地小于野生型對照的病斑面積;而過表達(dá)Bn MAM1和Bn CYP83A1的植株葉片和野生型對照在發(fā)病時(shí)期和控制病斑面積上均無顯著的差異。上述結(jié)果說明了脂肪族硫苷和吲哚族硫苷在甘藍(lán)型油菜植株葉片防御菌核病和灰霉病上發(fā)揮的作用并不相同,可以通過改變硫苷的種類或含量進(jìn)而提高植株對某些病菌的抗性。這些結(jié)果可為創(chuàng)建抗病育種材料以及制定育種策略提供參考信息。
【關(guān)鍵詞】：硫代葡萄糖苷 共表達(dá) R2R3-MYB 過表達(dá) 菌核病 灰霉病
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S332.2
【目錄】：

• 摘要8-11
• Abstract11-14
• 縮略詞表14-16
• 文獻(xiàn)綜述16-43
• 1 硫苷的綜述17-31
• 1.1 硫苷的結(jié)構(gòu)和分類17-18
• 1.2 硫苷的合成代謝18-26
• 1.2.1 R側(cè)鏈的延伸19-22
• 1.2.2 核心結(jié)構(gòu)的合成22-23
• 1.2.3 R側(cè)鏈的修飾23-26
• 1.3 硫苷的轉(zhuǎn)運(yùn)26
• 1.4 硫苷的降解代謝26-27
• 1.5 硫苷的生物學(xué)功能與人類的健康及其危害性27-31
• 1.5.1 植物體內(nèi)硫元素的平衡27-29
• 1.5.2 參與植物的防御機(jī)制29
• 1.5.3 賦予植物不同的風(fēng)味29
• 1.5.4 硫苷與人類的健康29-30
• 1.5.5 抗?fàn)I養(yǎng)作用30-31
• 2 硫苷代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的研究進(jìn)展31-39
• 2.1 MYB家族轉(zhuǎn)錄因子31-36
• 2.2 MYC家族轉(zhuǎn)錄因子36-38
• 2.3 其它轉(zhuǎn)錄因子38
• 2.4 植物激素對硫苷的影響38-39
• 3 硫苷防御功能的研究進(jìn)展39-42
• 3.1 硫苷的抗病性40-41
• 3.2 硫苷的抗蟲性41-42
• 4 本研究目的與意義的概述42-43
• 第一章 擬南芥中兩個(gè)保守的調(diào)控因子MYB115和MYB118調(diào)控新進(jìn)化的苯甲酰氧基硫苷代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)43-98
• 引言43-46
• 1 本研究的目的和意義46-47
• 2 材料和方法47-71
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料47-51
• 2.1.1 植物材料47
• 2.1.2 載體和菌株47-48
• 2.1.3 酶類48
• 2.1.4 生化試劑與耗材48
• 2.1.5 引物合成與測序分析48
• 2.1.6 軟件與數(shù)據(jù)分析48-49
• 2.1.7 實(shí)驗(yàn)儀器49
• 2.1.8 主要試劑的配置49-51
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法51-71
• 2.2.1 擬南芥的生長條件51
• 2.2.2 擬南芥插入突變體引物的篩選51-53
• 2.2.3 植物總DNA提�。–TAB法）53-54
• 2.2.4 植物組織總RNA提取的提取及反轉(zhuǎn)錄c DNA54-58
• 2.2.5 酵母單雜交分析58-66
• 2.2.6 q RT-PCR表達(dá)檢測66-68
• 2.2.7 構(gòu)建遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的載體68-70
• 2.2.8 硫苷的檢測分析70-71
• 3 結(jié)果與分析71-93
• 3.1 共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)MYB115和MYB118調(diào)控BZ-GLS代謝途徑71-73
• 3.2 酵母單雜和基因表達(dá)檢測（q RT-PCR）驗(yàn)證MYB115和MYB118調(diào)控硫苷代謝73-79
• 3.3 MYB115和MYB118調(diào)控種子中的多種硫苷含量79-81
• 3.4 MYB115和MYB118同時(shí)也影響葉片和花器官的硫苷含量81-84
• 3.5 互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了MYB115和MYB118的單突變體表型84-86
• 3.6 雙突變體表明MYB115和MYB118在調(diào)控硫苷合成時(shí)存在互作86-89
• 3.7 MYB115和MYB118對于硫苷合成的側(cè)鏈修飾途徑中的相關(guān)基因表現(xiàn)出不同的互作效應(yīng)89-93
• 4 討論93-97
• 4.1 擬南芥中兩個(gè)保守的轉(zhuǎn)錄因子MYB115和MYB118可以調(diào)控新進(jìn)化的基因AOP3和BZO1所合成的BZ-GLS的代謝93-95
• 4.2 MYB115和MYB118調(diào)控硫苷合成途徑的所有3個(gè)階段95
• 4.3 MYB115和MYB118的遺傳互作95-96
• 4.4 MYB115和MYB118不僅影響種子硫苷合成，同時(shí)也影響其它組織的硫苷代謝96-97
• 5 本章小結(jié)97-98
• 第二章 過表達(dá)甘藍(lán)型油菜中三個(gè)硫苷合成基因?qū)瞬『突颐共〉目剐缘难芯?/span>98-131
• 引言98-99
• 1 本研究的目的和意義99
• 2 材料和方法99-114
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料99-101
• 2.1.1 植物材料99
• 2.1.2 核盤菌和灰霉菌菌種99-100
• 2.1.3 載體和菌株100
• 2.1.4 酶類100
• 2.1.5 生化試劑與耗材100
• 2.1.6 引物合成與測序分析100
• 2.1.7 軟件與數(shù)據(jù)分析100-101
• 2.1.8 實(shí)驗(yàn)儀器101
• 2.1.9 主要試劑的配置101
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法101-114
• 2.2.1 甘藍(lán)型油菜的生長條件101-102
• 2.2.2 甘藍(lán)型油菜基因Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建102-104
• 2.2.3 甘藍(lán)型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化104-105
• 2.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定105-106
• 2.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的Southern分析106-110
• 2.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)分析（RT-PCR和q RT-PCR）110-111
• 2.2.7 油菜葉片接種核盤菌和灰霉菌111
• 2.2.8 油菜葉片硫苷的檢測與分析111-114
• 3 結(jié)果與分析114-126
• 3.1 克隆甘藍(lán)型油菜Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1基因114-116
• 3.2 Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1分別參與了核盤菌或灰霉菌侵染油菜時(shí)的響應(yīng)116-118
• 3.3 在甘藍(lán)型油菜中過表達(dá)Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1118-120
• 3.4 過表達(dá)Bn MAM1，，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1對油菜葉片硫苷含量的影響120-123
• 3.5 過表達(dá)Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1植株對核盤菌和灰霉菌的抗性分析123-126
• 4 討論126-129
• 4.1 Bn MAM1，Bn CYP83A1和Bn UGT74B1在甘藍(lán)型油菜硫苷合成途徑中的功能和作用126-127
• 4.2 脂肪族和吲哚族硫苷的抗病性127-128
• 4.3 轉(zhuǎn)基因?qū)χ仓瓴煌M織和器官硫苷合成和積累的影響128-129
• 4.4 此研究對抗病育種的啟發(fā)129
• 5 本章小結(jié)129-131
• 參考文獻(xiàn)131-147
• 附錄147-154
• 附錄1 本研究中所涉及到的硫苷的名稱、縮寫和化學(xué)結(jié)構(gòu)式147-150
• 附錄2 擬南芥中與AOP3、BZO1和SCPL17共表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子150-153
• 附錄3 作者簡介和在讀期間發(fā)表的論文153-154
• 致謝154-156

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：油菜和擬南芥中幾個(gè)硫代葡萄糖苷合成及調(diào)控基因的功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：296007