本文關(guān)鍵詞：甜菊苷對金黃色葡萄球菌性乳腺炎模型動物的保護作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：奶牛乳腺炎對奶牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展威脅巨大，不僅造成經(jīng)濟損失，還危害消費者健康。全世界各種類型乳腺炎患病率達到50%。我國是奶牛養(yǎng)殖大國，奶牛乳腺炎危害嚴重。病原微生物是引起乳腺炎的最主要原因，金黃色葡萄球菌是導致乳腺炎的重要致病菌。金葡菌能反復感染組織，釋放的外毒素可引起全身癥狀，導致奶牛死亡。目前治療奶牛乳腺炎的主要方法是應(yīng)用抗生素類藥物，但是長時間的抗生素治療，會使細菌產(chǎn)生抗藥性。金葡菌耐藥性菌株的產(chǎn)生使得其更加不易治愈�？股剡�會在乳汁中殘留，產(chǎn)生藥物殘留問題。金葡菌感染能引起炎癥、細胞凋亡，還能逃避免疫。因此，對金葡菌性乳腺炎的治療應(yīng)考慮抗炎、減少細菌誘導的細胞凋亡，增強天然免疫系統(tǒng)的殺菌作用。 抗炎療法是治療臨床型乳腺炎的重要方法。在應(yīng)用抗生素殺滅或抑制細菌的同時，應(yīng)配合抗炎藥來控制炎癥，減輕劇烈的炎癥反應(yīng)造成的組織損傷。另外減少細胞的死亡和增強機體天然免疫系統(tǒng)的效能也對治療有重要意義，增強免疫細胞對細菌的殺滅，通過減少細菌數(shù)量緩解炎癥和細胞死亡的發(fā)生。近年來中草藥治療奶牛乳腺炎受到廣泛關(guān)注。中草藥的純化提取物作為商品化藥物制劑也應(yīng)用于奶牛乳腺炎的治療。中草藥和其提取物可通過其具有的殺菌、抑菌作用，抗炎調(diào)節(jié)機體免疫的作用，既可單獨使用，也可以配合其他藥物使用，甚至可以減少抗生素的用量。甜菊苷是從菊科植物甜葉菊的葉子中提取的天然甜味劑，安全性高、無毒副 作用，在美國、歐洲、巴西、韓國、日本和我國，甜菊糖已經(jīng)被廣泛用于食品添加劑。甜菊苷本身具有一些治療性的功效，例如抗高血糖、抗高血壓、抗炎和調(diào)節(jié)免疫力等。本實驗旨在從多方面探索甜菊苷保護性作用的機制。鑒于使用本體動物牛進行動物實驗成本過高且不人道，我們使用小鼠建立金葡菌感染乳腺的急性動物模型。通過動物模型實驗，采用組織學觀察、TUNEL凋亡染色、ELISA、蛋白免疫印跡和熒光定量PCR等方法，研究甜菊苷對金葡菌感染的小鼠乳腺組織在病變、炎癥和細胞凋亡方面的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，金葡菌感染小鼠乳腺組織后，組織發(fā)生炎癥，炎性細胞因子分泌量升高，炎性信號通路和凋亡蛋白的活性升高，而甜菊苷在300,100,33mg/kg的濃度下減輕了炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，影響了NF κB和MAPK炎性信號通路蛋白和細胞凋亡蛋白的活性。 乳腺上皮細胞是乳腺組織最主要的功能性細胞，，為進一步確證甜菊苷對金葡菌感染細胞的保護作用，我們分離純化了小鼠乳腺上皮細胞，進行體外細胞實驗。先進行甜菊苷孵育后，再給予金葡菌刺激，檢測了炎性細胞因子的變化情況和NF κB、MAPK以及凋亡蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)甜菊苷在300,100,33μg/ml的濃度下抑制了NF κB、MAPK通路的主要蛋白p65、p38等的磷酸化和凋亡蛋白caspase 3、BAX的活化水平，進而減少了炎性細胞因子的分泌。TLR2功能之一就是識別金葡菌，并能夠啟動和調(diào)節(jié)下游炎癥和細胞凋亡信號。我們探討了在組織和細胞中甜菊苷對TLR2表達的影響，結(jié)果顯示，金葡菌感染時甜菊苷抑制了TLR2蛋白和mRNA表達水平，因此，TLR2對下游相關(guān)信號的激活也受到影響。細胞實驗的結(jié)果顯示，隨著TLR2的過度表達被抑制，其下游炎癥相關(guān)信號通路NF κB、MAPK和凋亡相關(guān)蛋白的磷酸化水平、活化程度也受到抑制，影響了炎癥和細胞凋亡的激活。對小鼠乳腺上皮細胞進行活/死細胞染色檢驗，結(jié)果顯示甜菊苷通過調(diào)節(jié)TLR2及其下游信號，減少了細胞死亡數(shù)量，起到了保護細胞的作用。另一方面，提高天然免疫系統(tǒng)對細菌的殺滅作用也是控制疾病的途徑。為了研究甜菊苷對天然免疫系統(tǒng)的影響，我們檢測了甜菊苷和中性粒細胞NETs網(wǎng)的聯(lián)合作用后細菌生長、炎性因子和相關(guān)蛋白的變化。分離純化了中性粒細胞后，將中性粒細胞生成的NETs網(wǎng)與甜菊苷共同作用于小鼠乳腺上皮細胞，再給予金葡菌刺激，以模擬金葡菌感染時天然免疫系統(tǒng)的部分作用效果。結(jié)果表明，甜菊苷和NETs網(wǎng)聯(lián)合作用時對細菌生長的抑制和對炎癥、細胞死亡的抑制效果都強于二者單獨作用。這說明甜菊苷對天然免疫系統(tǒng)中性粒細胞NETs網(wǎng)之間具有有協(xié)同作用。 綜上所述，通過動物實驗和體外細胞實驗結(jié)果表明，甜菊苷對金葡菌感染的乳腺組織具有抗炎和抗凋亡的保護作用，并且能夠與NETs網(wǎng)協(xié)同，增強乳腺組織免疫力。甜菊苷作為安全無毒的天然甜味劑，在藥用價值上有一定的潛力，具有一定的輔助治療效果。希望本論文研究結(jié)果能夠為金葡菌性奶牛乳腺炎的臨床治療和抗炎、保健藥品的開發(fā)提供一定的幫助。
【關(guān)鍵詞】：甜菊苷 金黃色葡萄球菌乳腺炎 抗炎 抗凋亡 協(xié)同NETs網(wǎng)
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S853.74
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 英文縮寫詞表14-16
• 引言16-18
• 第一篇 文獻綜述18-48
• 第一章 金葡菌性奶牛乳腺炎研究進展18-25
• 1.1 奶牛乳腺炎的危害18-19
• 1.2 奶牛乳腺炎的類型和癥狀19-21
• 1.3 奶牛乳腺炎的發(fā)病因素21-22
• 1.4 金黃色葡萄球菌性奶牛乳腺炎的治療22-23
• 1.5 奶牛乳腺炎的預防23-25
• 第二章 金黃色葡萄球菌的致病機制25-43
• 2.1 金葡菌感染的特點和危害25-27
• 2.2 金葡菌的毒力因子27-30
• 2.3 金葡菌感染后宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)30-34
• 2.4 金葡菌免疫逃避的特點34-36
• 2.5 金葡菌對宿主炎癥和凋亡的影響36-43
• 2.5.1 NF-κB 信號通路37-38
• 2.5.2 MAPK 信號通路38-39
• 2.5.3 金葡菌感染后引起宿主細胞的凋亡39-43
• 第三章 甜菊苷研究進展43-48
• 第二篇 研究內(nèi)容48-100
• 第一章 甜菊苷對金葡菌感染的小鼠乳腺組織的保護作用48-70
• 1.1 材料49-52
• 1.1.1 實驗動物49-50
• 1.1.2 實驗菌株50
• 1.1.3 主要試劑和耗材50-51
• 1.1.4 實驗儀器設(shè)備51
• 1.1.5 溶液和試劑配方51-52
• 1.2 方法52-59
• 1.2.1 小鼠金葡菌性乳腺炎動物模型建立與分組52-53
• 1.2.2 乳腺組織病理組織學觀察53
• 1.2.3 乳腺組織 TUNEL 染色觀察53-54
• 1.2.4 乳腺組織細胞因子檢測54-55
• 1.2.5 乳腺組織總蛋白提取和蛋白表達檢測55-58
• 1.2.6 乳腺組織 RNA 提取58
• 1.2.7 乳腺組織熒光定量 PCR 檢測58-59
• 1.2.8 數(shù)據(jù)處理59
• 1.3 結(jié)果59-66
• 1.3.1 乳腺病理組織學觀察59-60
• 1.3.2 乳腺組織 TUNEL 染色凋亡觀察60-61
• 1.3.3 甜菊苷對炎性因子的影響61-62
• 1.3.4 甜菊苷對金葡菌感染的小鼠乳腺組織 NF-κB 通路 IκBα和 p65的影響62-63
• 1.3.5 甜菊苷對金葡菌感染的小鼠乳腺組織 MAPK 通路 p38、JNK 和ERK 的影響63-64
• 1.3.6 甜菊苷對健康小鼠乳腺組織 NF-κB 和 MAPK 信號通路影響64-65
• 1.3.7 甜菊苷對金葡菌感染的小鼠乳腺組織凋亡相關(guān)蛋白的影響65-66
• 1.4 討論66-68
• 1.5 小結(jié)68-70
• 第二章 甜菊苷對金葡菌感染的小鼠乳腺上皮細胞的保護作用機制70-86
• 2.1 材料71-72
• 2.1.1 實驗動物71
• 2.1.2 實驗菌株71
• 2.1.3 化學藥品及生物試劑71
• 2.1.4 試劑配制71-72
• 2.2 試驗方法72-75
• 2.2.1 細胞模型試驗分組72
• 2.2.2 小鼠乳腺上皮細胞的分離純化步驟72-74
• 2.2.3 小鼠乳腺上皮細胞生化鑒定74
• 2.2.4 甜菊苷對細胞的毒性實驗（CCK）74
• 2.2.5 甜菊苷對金葡菌刺激的小鼠乳腺上皮細胞炎性因子的影響74-75
• 2.2.6 小鼠乳腺上皮細胞總蛋白提取和表達水平檢測75
• 2.2.7 小鼠小鼠乳腺上皮細胞總 mRNA 和相關(guān)基因表達檢測75
• 2.2.8 小鼠乳腺上皮細胞 LIVE/DEAD 死亡檢測75
• 2.2.9 數(shù)據(jù)處理75
• 2.3 結(jié)果75-82
• 2.3.1 小鼠乳腺上皮細胞的分離純化結(jié)果75-76
• 2.3.2 甜菊苷細胞毒性細胞生長實驗 CKK76
• 2.3.3 甜菊苷對金葡菌刺激的小鼠乳腺上皮細胞炎性因子的影響76-77
• 2.3.4 甜菊苷對金葡菌刺激的小鼠乳腺上皮細胞 NF-κB、MAPKs 信號通路 IκBα、p65、p38、ERK 和 JNK 的影響77-79
• 2.3.5 甜菊苷對金葡菌刺激的小鼠乳腺上皮細胞凋亡蛋白的影響79-80
• 2.3.6 甜菊苷對金葡菌刺激的小鼠乳腺上皮細胞的保護作用80-81
• 2.3.7 甜菊苷對金葡菌感染乳腺和細胞時 TLR2 表達的影響81-82
• 2.4 討論82-85
• 2.5 小結(jié)85-86
• 第三章 甜菊苷與中性粒細胞 NETs 捕網(wǎng)的協(xié)同作用86-100
• 3.1 材料87-88
• 3.1.1 實驗動物87
• 3.1.2 實驗菌株87
• 3.1.3 化學藥品及生物試劑87
• 3.1.4 實驗儀器設(shè)備87-88
• 3.2 方法88-91
• 3.2.1 甜菊苷對金葡菌感染的小鼠乳腺組織中髓過氧化物酶的影響88
• 3.2.2 中性粒細胞的提取純化和 NETs 網(wǎng)的誘導生成88-89
• 3.2.3 甜菊苷和 NETs 網(wǎng)對金葡菌生長的影響89-90
• 3.2.4 甜菊苷和 NETs 網(wǎng)對金葡菌引發(fā)的炎癥的影響90
• 3.2.5 甜菊苷和 NETs 網(wǎng)的聯(lián)合作用對金葡菌刺激時 NF-κB 和MAPKs 通路蛋白的影響90-91
• 3.2.6 甜菊苷和 NETs 網(wǎng)的聯(lián)合作用對金葡菌刺激時細胞凋亡蛋白的影響91
• 3.2.7 數(shù)據(jù)處理91
• 3.3 結(jié)果91-96
• 3.3.1 甜菊苷對金葡菌感染的小鼠乳腺組織中髓過氧化物酶（MPO）活性的影響91-92
• 3.3.2 甜菊苷和 NETs 網(wǎng)對金葡菌生長的影響92
• 3.3.3 甜菊苷和 NETs 網(wǎng)對金葡菌引發(fā)的炎性因子的影響92-93
• 3.3.4 甜菊苷和 NETs 網(wǎng)的聯(lián)合作用對金葡菌刺激時乳腺上皮細胞NF-κB、MAPKs 通路 IκBα、p65、p38、ERK 和 JNK 的影響93-95
• 3.3.5 甜菊苷和 NETs 網(wǎng)的聯(lián)合作用對金葡菌刺激時細胞凋亡蛋白的影響95-96
• 3.4 討論96-98
• 3.5 小結(jié)98-100
• 結(jié)論100-101
• 參考文獻101-122
• 導師簡介122-124
• 作者簡介及在學期間所取得的科研成果124-125
• 致謝125

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 毛近隆;;天然活性成分甜菊苷化學結(jié)構(gòu)修飾的研究進展[J];北京聯(lián)合大學學報(自然科學版);2011年01期

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5 韓超;;規(guī)模奶牛場乳房炎防治綜合措施[J];中國奶牛;2013年05期

  本文關(guān)鍵詞：甜菊苷對金黃色葡萄球菌性乳腺炎模型動物的保護作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：294918