本文關(guān)鍵詞：mTOR信號通路在LPS誘導肉雞腸道黏膜免疫應激中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腸道黏膜免疫系統(tǒng)在機體的免疫應答中發(fā)揮著重要作用,本研究即以LPS激發(fā)炎癥反應為基礎建立活體和離體培養(yǎng)的腸道組織的免疫應激模型,探討mTOR/p70S6K參與LPS激活的免疫應答機制,并從日糧營養(yǎng)素的角度進一步分析營養(yǎng)對免疫機能的調(diào)控,初步探討mTOR/p70S6K參與營養(yǎng)素調(diào)控的機制。1.RAPA處理對肉雞腸道黏膜發(fā)育的影響應用mTOR的特異性抑制劑-雷帕霉素(RAPA)研究對腸道黏膜發(fā)育的影響。4d時,選取體重相近的90只肉雞,分別腹腔注射0.4 mg/kg BW(低劑量)、1.0 mg/kg BW(高劑量)和RAPA溶解介質(zhì)(對照),每天定點注射一次,連續(xù)注射6d。試驗結(jié)果顯示,RAPA能顯著的影響體重和腸道絨毛發(fā)育,導致體重明顯下降(P0.05),絨毛萎縮、變短(P0.05),死亡率升高(P0.05);并能顯著地降低腸道緊密連接蛋白Claudin1的蛋白表達(P0.05)。同時,免疫組化和Western Blot顯示腸道IgA表達顯著降低(P0.05),這表明mTOR參與腸道黏膜的發(fā)育和IgA蛋白的合成,在體內(nèi)腸道黏膜穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。2.口服LPS誘導的免疫應激對腸道黏膜免疫的影響機制試驗對4d的AA肉雞分別給予0.25mg/kg BW和0.50 mg/kg BW的LPS口服處理,研究在LPS處理后4h-24h不同時間點對腸道黏膜免疫機制的影響。檢測洗液中SIgA的濃度結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同濃度的LPS口服對十二指腸和空腸沒有顯著的影響,在回腸中表現(xiàn)出有差異,尤其是500μg/kg BW的LPS處理后在回腸中呈現(xiàn)出時間依賴性的規(guī)律性增加;同時,LPS處理后4h-6h的NF-κBp65和p38 MAPK蛋白表達顯著升高(P0.05),隨著時間延長差異漸小,至18h,21h時兩者的蛋白表達顯著降低(P0.05)。結(jié)果表明,口服LPS處理可以引起腸道黏膜的免疫應激,并能影響腸道表現(xiàn)在時間和空間的特異性。3.體外腸道組織的培養(yǎng)及其建立的LPS免疫應激模型試驗應用19胚齡的SPF雞胚建立離體的腸道組織培養(yǎng)模型,并分別用0,0.5,1,2μg/m L的LPS給予免疫應激,觀察LPS處理2h和4h后對腸道組織的影響。結(jié)果顯示,SIgA的濃度在LPS處理后2h隨著LPS濃度的增加表現(xiàn)為逐漸升高的趨勢,且在2μg/m L的LPS處理后差異顯著(P0.05);各種炎性細胞因子的mRNA水平和NF-κB、MAPK信號蛋白的磷酸化水平結(jié)果也顯示,不同濃度的lps均顯著的激活細胞因子的表達和nf-κb、mapk信號通路,尤以2μg/ml的lps處理2h的差異最顯著(p0.05),表明lps可以引發(fā)體外培養(yǎng)的腸道組織的免疫應激,激活tlr-nf-κb、mapk-炎性細胞因子-siga信號通路。4.mtor參與調(diào)節(jié)lps誘導的炎性機制應用試驗3中模型,檢測可能與siga等蛋白合成相關(guān)的mtor信號通分子,結(jié)果顯示,lps處理腸道組織后,其mtor/p70s6k的磷酸化水平均顯著地降低(p0.05),這提示mtor信號通路可能參與lps誘導的炎癥反應機制。同時,應用試驗3中2μg/ml的lps處理2h建立的體外培養(yǎng)模型,用10mm、20mm和40mm的leu來激活被抑制的mtor信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn),40mm的leu恢復了由lps抑制的mtor/p70s6k的磷酸化水平,并抑制了由單獨lps處理顯著激活的炎性細胞因子、siga以及nf-κbp65、p38,jnkmapk蛋白的磷酸化水平,這表明mtor/p70s6k信號通路參與lps誘導的炎性反應,調(diào)控下游信號分子的免疫應答。5.mtor參與5-htp、va等營養(yǎng)素調(diào)控免疫應激的機制初探本試驗探討了日糧中添加5-htp或va對lps誘導的免疫應激炎性反應的調(diào)控作用。選取80只體重相近的肉雞,7d開始飼喂0.2%的5-htp日糧和基礎日糧,連續(xù)飼喂4w后腹腔注射1mg/kgbwlps。結(jié)果顯示,基礎日糧下,lps能顯著地降低了mtor下游的p70s6k的磷酸化水平(p0.05),顯著地激活il-6等炎性細胞因子和nf-κb、mapk信號分子的表達(p0.05);而5-htp日糧能降低炎性細胞因子的mrna水平,且有效抑制了由lps激活的nf-κb/mapk-細胞因子的信號通路,這表明5-htp緩解了lps應激誘導的炎性反應;同時5-htp日糧也恢復了由lps抑制的mtor下游的p70s6k的磷酸化水平,提高了十二指腸洗液中siga的濃度(p0.05)。同時,選取80只體重相近的肉雞,1d開始飼喂1500iu/kg和6000iu/kg的兩種梯度va日糧,連續(xù)飼喂10d后,應用對呼吸道黏膜造成免疫應激的lps(1mg/kgbw)進行噴霧2h處理。結(jié)果顯示,基礎日糧下,lps噴霧處理顯著的激活了il-6、tnf-α等炎性因子的基因表達和p38mapk的總蛋白表達(p0.05),而日糧添加va后,lps噴霧處理后未見有炎性細胞因子的高表達和炎性通路的激活,同時腸道緊密連接蛋白的表達也相應升高(p0.05),且p70s6k的磷酸化水平較基礎日糧組顯著升高(p0.05),這體現(xiàn)了va日糧對機體的保護作用,免受外界應激的刺激損傷,增強機體免疫力。本試驗提示mTOR/p70S6K信號通路可能參與營養(yǎng)素調(diào)控免疫應激對腸道黏膜免疫的機制中。綜上所述,mTOR信號分子參與肉雞腸道黏膜的發(fā)育和SIgA蛋白的合成,同時應用離體培養(yǎng)的腸道組織模型證實mTOR/p70S6K在LPS誘導的炎癥反應機制中發(fā)揮負調(diào)控作用。同時發(fā)現(xiàn)5-HTP和VA等營養(yǎng)素能緩解不同方式的LPS應激對腸道造成的炎性反應,也提示mTOR/p70S6K參與到營養(yǎng)素調(diào)控腸道黏膜免疫機制中。這對家禽相關(guān)應激的預防及營養(yǎng)素添加的調(diào)節(jié)機制研究有著十分重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：腸道黏膜免疫 離體腸道組織培養(yǎng) 炎性反應 營養(yǎng)素 LPS mTOR/p70S6K SIgA
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 符號說明5-12
• 中文摘要12-15
• Abstract15-19
• 1 前言19-38
• 1.1 家禽黏膜免疫系統(tǒng)19-23
• 1.1.1 家禽黏膜免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)19-20
• 1.1.2 家禽黏膜免疫系統(tǒng)的功能20-21
• 1.1.2.1 特異性免疫功能20
• 1.1.2.2 非特異性免疫功能20
• 1.1.2.3 免疫耐受20-21
• 1.1.3 腸道黏膜免疫系統(tǒng)的特點21-22
• 1.1.4 家禽黏膜免疫的調(diào)節(jié)22-23
• 1.1.4.1 黏膜上皮細胞的調(diào)節(jié)作用22-23
• 1.1.4.2 T細胞和B細胞的調(diào)節(jié)作用23
• 1.2 黏膜免疫主要效應因子SIgA23-24
• 1.2.1 SIgA的結(jié)構(gòu)23-24
• 1.2.2 SIgA在黏膜免疫應答中的作用24
• 1.3 免疫應激24-26
• 1.3.1 應激概述24-25
• 1.3.2 免疫應激25-26
• 1.3.3 免疫應激對家禽的影響26
• 1.4 LPS誘導的免疫應激26-32
• 1.4.1 LPS的特性26-27
• 1.4.2 LPS建立模型27-28
• 1.4.3 LPS免疫應激介導的炎癥細胞因子的釋放28-29
• 1.4.4 LPS免疫應激的作用機制（NF-κB信號通路）29-30
• 1.4.5 LPS免疫應激的作用機制（MAPKs信號通路）30-32
• 1.5 mTOR信號通路32-35
• 1.5.1 mTOR概述32-33
• 1.5.2 mTOR作用33
• 1.5.3 mTOR與炎性反應33-34
• 1.5.4 Leu對mTOR的調(diào)控作用34-35
• 1.6 營養(yǎng)與腸道黏膜免疫35-37
• 1.6.1 維生素A（VA）35-36
• 1.6.2 5-羥色氨酸（5-HTP）36-37
• 1.7 選題目的及意義37-38
• 2 材料與方法38-54
• 2.1 試驗動物管理38
• 2.2 試驗雞胚38
• 2.3 試驗試劑與主要儀器38-42
• 2.4 試驗設計42-47
• 2.4.1 RAPA處理對腸道黏膜發(fā)育和免疫的影響42
• 2.4.1.1 試驗處理42
• 2.4.1.2 樣品采集42
• 2.4.1.3 測定指標42
• 2.4.2.服LPS對腸道組織的影響42-43
• 2.4.2.1 試驗處理42-43
• 2.4.2.2 采集樣品43
• 2.4.2.3 指標測定43
• 2.4.3 原代腸道上皮細胞的培養(yǎng)43
• 2.4.4 體外腸道組織的培養(yǎng)及體外LPS免疫應激模型的建立43-44
• 2.4.4.1 試驗處理43
• 2.4.4.2 采集樣品43
• 2.4.4.3 指標檢測43-44
• 2.4.5 mTOR參與LPS誘導的信號通路44
• 2.4.5.1 試驗處理44
• 2.4.5.2 樣品采集44
• 2.4.5.3 指標檢測44
• 2.4.6 mTOR參與營養(yǎng)素調(diào)控LPS免疫應激的初探44-47
• 2.4.6.1 試驗處理44-46
• 2.4.6.2 樣品采集46
• 2.4.6.3 指標檢測46-47
• 2.5 試驗方法47-53
• 2.5.1 腸道原代上皮細胞的培養(yǎng)47
• 2.5.2 小腸絨毛高度和隱窩深度的測定47-48
• 2.5.3 免疫組化定位IgA的陽性信號48
• 2.5.4 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測SIgA效價48-49
• 2.5.5 相關(guān)基因mRNA水平檢測49-52
• 2.5.5.1 組織中提取總RNA49
• 2.5.5.2 RNA濃度的測定49-50
• 2.5.5.3 反轉(zhuǎn)錄50
• 2.5.5.4 熒光定量PCR50-52
• 2.5.6 蛋白提取和Western Blotting52-53
• 2.5.6.1 組織蛋白的提取52
• 2.5.6.2 組織蛋白濃度的測定52
• 2.5.6.3 蛋白變性52
• 2.5.6.4 Western Blotting52-53
• 2.6 數(shù)據(jù)處理53-54
• 3 結(jié)果與分析54-76
• 3.1 RAPA處理對腸道黏膜發(fā)育和免疫的影響54-59
• 3.1.1 體重變化54
• 3.1.2 形態(tài)學觀察54-56
• 3.1.3 免疫組化定位空腸IgA的陽性信號56-57
• 3.1.4 mTOR，IgA，Claudin1和Occludin的相對表達量57-59
• 3.2.服LPS對腸道黏膜免疫應激的影響機制59-62
• 3.2.1.服不同濃度LPS對腸道黏膜中SIgA分泌的影響59-60
• 3.2.2 參與調(diào)控LPS免疫應激的信號通路60-62
• 3.2.2.1 不同時間點IgA和TLR4的mRNA表達水平60-61
• 3.2.2.2 不同時間點NF-κB p65和p38 MAPK蛋白的表達水平61-62
• 3.3 腸道上皮細胞的原代培養(yǎng)62
• 3.4 LPS應激體外培養(yǎng)的腸道組織模型62-66
• 3.4.1 腸道組織的體外培養(yǎng)62-63
• 3.4.2 LPS應激對培養(yǎng)液上清中SIgA濃度的影響63-64
• 3.4.3 LPS處理對相關(guān)細胞因子在不同時間點的影響64-65
• 3.4.4 LPS處理對MAPK和NF-κB信號分子的影響65-66
• 3.4.5 LPS處理對mTOR信號分子的影響66
• 3.5 mTOR參與調(diào)控LPS誘導的信號通路66-69
• 3.5.1 mTOR調(diào)節(jié)LPS誘導的SIgA合成66-67
• 3.5.2 mTOR參與調(diào)節(jié)LPS誘導的細胞因子的表達67
• 3.5.3 mTOR參與調(diào)節(jié)LPS誘導的MAPK、NF-κB信號67-69
• 3.6 mTOR參與營養(yǎng)素調(diào)控LPS免疫應激的初探69-76
• 3.6.1 mTOR參與 5-HTP日糧的調(diào)控機制研究69-72
• 3.6.1.1 血清和各段腸道黏膜中分泌的SIgA的濃度69-70
• 3.6.1.2 5-HTP對十二指腸中不同細胞因子的調(diào)控作用70
• 3.6.1.3 5-HTP對mTOR、MAPK和NF-κB信號蛋白的調(diào)控作用70-72
• 3.6.2 mTOR參與VA日糧的調(diào)控機制研究72-76
• 3.6.2.1 各段腸道黏膜中分泌的SIgA的濃度72
• 3.6.2.2 VA對十二指腸中不同細胞因子的調(diào)控作用72-73
• 3.6.2.3 VA對mTOR/p70S6K和MAPK、NF-κB信號蛋白的調(diào)控作用73-76
• 4 討論76-88
• 4.1 mTOR信號對腸道黏膜發(fā)育和免疫的影響76-77
• 4.2.服LPS對腸道黏膜免疫的影響機制77-79
• 4.3 建立體外培養(yǎng)的腸道組織模型79-82
• 4.3.1 體外腸道組織的培養(yǎng)79
• 4.3.2 體外腸道組織建立的免疫應激模型79-81
• 4.3.3 LPS負調(diào)控mTOR信號通路81-82
• 4.4 mTOR參與調(diào)控LPS誘導的免疫應激82-83
• 4.4.1 Leu抑制LPS激活的SIgA82
• 4.4.2 Leu緩解LPS抑制的mTOR及其下游信號表達82-83
• 4.4.3 mTOR參與調(diào)控LPS激活的免疫應答83
• 4.5 mTOR參與營養(yǎng)素的調(diào)控機制初探83-88
• 4.5.1 mTOR參與 5-HTP日糧的調(diào)控機制研究84-85
• 4.5.2 mTOR參與VA日糧的調(diào)控機制研究85-88
• 5 結(jié)論88-89
• 參考文獻89-103
• 致謝103-104
• 攻讀博士期間待發(fā)表與已發(fā)表論文情況104

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李曉晴;楊仙珊;趙鵬;丁美;趙軍;段鐘平;張晶;;人肝細胞系5-羥色胺自分泌系統(tǒng)的研究[J];肝臟;2010年04期

  本文關(guān)鍵詞：mTOR信號通路在LPS誘導肉雞腸道黏膜免疫應激中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：293271