本文關(guān)鍵詞：骨保護素對破骨細胞及其前體黏附結(jié)構(gòu)和融合的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡是動物主要的健康問題之一。破骨細胞的分化和活化,在健康動物及患病動物骨重塑中起著至關(guān)重要的作用。破骨細胞具有骨吸收活性,由單核細胞巨噬細胞／單核細胞譜系的造血前體細胞融合形成。破骨細胞通過偽足小體,一種特異性的黏附結(jié)構(gòu),附著在細胞外基質(zhì)上。偽足小體可形成F-actin環(huán),類似于進行骨吸收的破骨細胞形成的環(huán)狀封閉帶。骨保護素(OPG)和核因子KB受體激活劑(RANK)都是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員,通過和RANK配體(RANKL)競爭性地結(jié)合,調(diào)控破骨細胞形成和功能。RANKL通過激活RANK,促進破骨細胞分化；而OPG連接至RANKL,抑制破骨細胞形成。已有研究發(fā)現(xiàn)了OPG作用于破骨細胞分化、融合及黏附的一些重要細節(jié)。但這些研究主要集中在編碼破骨細胞特異性標志物,潛在的融合因子和黏附相關(guān)調(diào)控因子基因的表達,通過體外阻斷,或過表達方式來研究。因此,OPG抑制破骨細胞分化、融合和黏附的許多重要分子機制仍不明確。本研究以25 ng/mL M-CSF和30 ng/mL RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細胞分化形成的破骨細胞為研究對象,在分化過程中添加不同濃度OPG進行處理,通過形態(tài)學(xué)鑒定、實時細胞動態(tài)分析(RTCA)、免疫印跡法(Western blot)等技術(shù)手段,探索OPG對破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)和融合的影響,揭示相關(guān)調(diào)控機制,為進一步闡明OPG對破骨細胞形成及功能的抑制作用提供了理論依據(jù)。研究內(nèi)容如下：1.OPG對不同分化階段破骨細胞的形成及功能的影響為了研究OPG對不同分化階段破骨細胞的黏附及活性的影響,本實驗采用M-CSF和RANKL處理RAW264.7細胞,培養(yǎng)1、3、5、7 d后,各組分別添加80 ng/mL OPG作用24 h�？咕剖崴嵝粤姿崦�(TRAP)染色和免疫熒光檢測破骨細胞分化和黏附能力的變化,RTCA監(jiān)測細胞生長曲線變化,Western blot檢測TRAP、RANK、integrin β3、 matrix metalloproteinase 9 (MMP9)、 cathepsin K、carbonic anhydrase Ⅱ(CA Ⅱ) 及 vesicular-type H+-ATPase A1 (V-ATPase A1)蛋白表達量的變化。結(jié)果顯示,OPG處理顯著增強分化初期細胞(1 d)的存活、增殖及黏附能力,并促進RANK和integrin (β3表達量顯著增高(p0.01)。相反,和對照組相比,OPG抑制成熟的破骨細胞(3-7d)的分化及黏附結(jié)構(gòu)的形成,并顯著降低了TRAP、RANK、integrin β3、MMP9、cathepsin K、CA Ⅱ及V- ATPase A1標志性蛋白的表達水平(p0.01)。說明OPG對于破骨細胞分化不同階段的生物效應(yīng)是有差異的,促進破骨細胞前體的黏附和存活,抑制各階段破骨細胞的分化,并降低分化至中末期的成熟的破骨細胞活性。2.OPG對破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)的影響及調(diào)控機理為了揭示OPG對破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)、黏附相關(guān)蛋白表達及分布的影響,本實驗采用M-CSF和RANKL處理RAW264.7細胞3d后,在無血清培養(yǎng)條件下,加入不同濃度OPG(0、20、40、80 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,TRAP染色檢測不同劑量OPG對破骨細胞分化的影響,掃描電子顯微鏡(SEM)、RTCA及激光共聚焦技術(shù)觀察破骨細胞外周黏附結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化,Western blot檢測Pyk2和Src酪氨酸磷酸化水平。結(jié)果表明,OPG能夠抑制破骨細胞的分化,使細胞黏附結(jié)構(gòu)收縮且呈時間和劑量依賴關(guān)系。結(jié)合激光共聚焦和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),OPG導(dǎo)致破骨細胞Pyk2發(fā)生去磷酸化,降低了Pyk2在細胞外周黏附結(jié)構(gòu)區(qū)域的表達及分布,誘導(dǎo)Tyr 402 Pyk2和Tyr 416 Src向細胞中央聚集,提高了其在細胞中央的表達量,但顯著降低了Tyr 527 Src磷酸化水平(p0.01),增強了Pyk2和Src在破骨細胞中央?yún)^(qū)域的聯(lián)系。表明,破骨細胞為了適應(yīng)OPG的調(diào)控,將Src作為銜接蛋白,代償減少的Pyk2,并與Pyk2一起從破骨細胞外周黏附區(qū)域向中心區(qū)域轉(zhuǎn)移。說明,OPG通過調(diào)控破骨細胞內(nèi)Pyk2和Src磷酸化及其在細胞內(nèi)的分布情況,破壞破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)。3.OPG調(diào)控破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)的Ca2+、ERK和p38 MAPK信號通路為了探討Ca2+和MAPKs信號通路在OPG調(diào)控破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)中的作用,本實驗以細胞內(nèi)鈣離子螫合劑Bapta-AM(5μM),ERK抑制劑U0126(5 μM)和p38抑制劑SB202190(10μM)與OPG (40 ng/mL)聯(lián)合作用破骨細胞。3h后,TRAP染色、SEM、RTCA、流式細胞術(shù)和Western blot分別檢測破骨細胞的生成、活力、黏附結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化,細胞內(nèi)游離Ca2+濃度[Ca2+]i、Pyk2和Src的磷酸化狀態(tài)。結(jié)果表明,OPG抑制了破骨細胞生成和黏附結(jié)構(gòu)的形成,顯著降低了[Ca2+]i、Pyk2和Src-pY527磷酸化水平(p0.01),并使Src-pY416磷酸化水平顯著增高(p0.01)。Bapta-AM、U0126和SB202190明顯抑制了OPG對破骨細胞分化和黏附結(jié)構(gòu)的作用。Bapta-AM和U0126使降低的[Ca2+]i、Pyk2和Src-pY527磷酸化水平恢復(fù)至對照組水平,而SB202190沒有這種作用。這三種抑制劑都抑制了OPG引起的Src-pY416磷酸化水平升高。說明,OPG通過Ca2+和ERK信號通路破壞破骨細胞黏附結(jié)構(gòu),激活Src使其作為銜接蛋白補充減少的磷酸化Pyk2,而p38 MAPK信號通路可能在這過程中發(fā)揮著不同的作用。4.OPG抑制破骨細胞及其前體融合的調(diào)控機理為了揭示OPG對破骨細胞及其前體融合的分子調(diào)控機理,本研究利用OPG(40ng/mL)單獨或聯(lián)合ATP (100μM)作用破骨細胞48 h, TRAP染色、RTCA、Western blot和激光共聚焦分別檢測破骨細胞及前體細胞的分化、融合率、融合關(guān)鍵因子(CD44、CD47、 DC-STAMP、 ATP6V0D2及Cx43)的表達量和定位變化。結(jié)果表明,OPG抑制了多核破骨細胞的形成,與OPG組比較,OPG與ATP聯(lián)合作用,多核破骨細胞(以細胞核數(shù)目分類)數(shù)目顯著增多(p0.01)。與對照組比較,OPG僅減少破骨細胞前體CD47的表達量,并使多核的破骨細胞CD44、CD47、DC-STAMP、ATP6V0D2和總Cx43的表達水平顯著下降(p0.01)；與OPG組比較,OPG與ATP聯(lián)合作用,這些融合相關(guān)因子的表達量顯著上升(p0.01)。而OPG降低了破骨細胞及前體細胞中CD44+、CD47+、DC-STAMP+、 ATP6V0D2+、Cx43+細胞在總體的分布比例(p0.01)。表明OPG通過不同的機制分別調(diào)控多核的破骨細胞和單核的前體細胞融合,這些調(diào)控機制都可能涉及ATP信號通路。
【關(guān)鍵詞】：骨保護素 破骨細胞 分化 黏附結(jié)構(gòu) Src Pyk2 Ca~(2+) MAPKs 融合 ATP
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.2
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-14
• 符號說明14-18
• 第一部分 文獻綜述18-53
• 第一章 破骨細胞融合及相關(guān)調(diào)控機理18-27
• 1 破骨細胞的融合18-19
• 2 破骨細胞融合的生物學(xué)意義19-21
• 3 調(diào)控破骨細胞融合的關(guān)鍵因子21-27
• 3.1 RANKL依賴性融合相關(guān)因子21-23
• 3.2 RANKL非依賴性融合相關(guān)因子23-25
• 3.3 膜結(jié)構(gòu)域和因子間的相互作用25-27
• 第二章 OPG與骨骼疾病27-36
• 1 OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)29-31
• 1.1 OPG及RANKL的發(fā)現(xiàn)29
• 1.2 OPG及RANK/RANKL的功能29-30
• 1.3 OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)與骨骼疾病30-31
• 2 破骨細胞相關(guān)疾病31-34
• 2.1 骨質(zhì)疏松31-32
• 2.2 關(guān)節(jié)炎32-33
• 2.3 骨髓瘤骨病33-34
• 2.4 Paget病34
• 3 OPG在臨床診斷中的應(yīng)用34-35
• 4 OPG在臨床治療中的應(yīng)用35-36
• 5 本研究的目的意義36
• 參考文獻36-53
• 第二部分 試驗研究53-115
• 第一章 OPG對不同分化階段破骨細胞的形成及功能的影響53-69
• 1 材料和方法53-57
• 1.1 實驗細胞株53-54
• 1.2 主要儀器54
• 1.3 主要化學(xué)試劑54
• 1.4 細胞培養(yǎng)及處理54-55
• 1.5 破骨細胞TRAP染色55
• 1.6 xCelligence系統(tǒng)檢測細胞生長曲線變化55
• 1.7 免疫熒光檢測細胞黏附結(jié)構(gòu)55-56
• 1.8 免疫印跡法檢測破骨細胞標志性蛋白的表達56
• 1.9 數(shù)據(jù)分析56-57
• 2 結(jié)果57-63
• 2.1 OPG對不同分化階段破骨細胞形成的影響57-60
• 2.2 OPG對不同分化階段的破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)的影響60-62
• 2.3 OPG對不同分化階段破骨細胞特征性蛋白表達的影響62-63
• 3 討論63-65
• 參考文獻65-69
• 第二章 OPG對破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)的影響及調(diào)控機理69-85
• 1 材料和方法69-71
• 1.1 實驗細胞株69-70
• 1.2 主要儀器70
• 1.3 主要化學(xué)試劑70
• 1.4 細胞培養(yǎng)及處理70
• 1.5 xCelligence系統(tǒng)檢測生長曲線變化70
• 1.6 破骨細胞TRAP染色及計數(shù)70
• 1.7 掃描電鏡觀察破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)70-71
• 1.8 免疫熒光及激光共聚焦觀察黏附相關(guān)蛋白的分布71
• 1.9 免疫印跡法檢測黏附相關(guān)蛋白的表達71
• 1.10 數(shù)據(jù)分析71
• 2 結(jié)果71-79
• 2.1 OPG對破骨細胞分化的影響71-72
• 2.2 OPG對破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)的影響72-74
• 2.3 OPG對Pyk2和Src酪氨酸磷酸化的影響74-76
• 2.4 OPG對破骨細胞Pyk2和Src分布的影響76-79
• 3 討論79-81
• 參考文獻81-85
• 第三章 OPG調(diào)控破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)的Ca2+、ERK和p38 MAPK信號通路85-101
• 1 材料和方法85-87
• 1.1 實驗細胞株85-86
• 1.2 主要儀器86
• 1.3 主要化學(xué)試劑86
• 1.4 細胞培養(yǎng)及處理86
• 1.5 xCelligence系統(tǒng)檢測細胞生長曲線變化86
• 1.6 破骨細胞TRAP染色及計數(shù)86
• 1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度[Ca~(2+)]_i86-87
• 1.8 掃描電鏡觀察破骨細胞形態(tài)變化87
• 1.9 免疫印跡法檢測黏附相關(guān)蛋白的表達87
• 1.10 數(shù)據(jù)分析87
• 2 結(jié)果87-95
• 2.1 Ca~(2+)、Erk和p38 MAPK抑制劑對OPG調(diào)控破骨細胞分化的影響87-89
• 2.2 Ca~(2+)、Erk和p38 MAPK抑制劑對OPG調(diào)控破骨細胞黏附結(jié)構(gòu)的影響89-92
• 2.3 Ca~(2+)、Erk和p38 MAPK抑制劑對OPG調(diào)控[Ca~(2+)]_i的影響92-93
• 2.4 Ca~(2+)、Erk和p38 MAPK抑制劑對OPG介導(dǎo)破骨細胞Pyk2和Src磷酸化的影響93-95
• 3 討論95-97
• 參考文獻97-101
• 第四章 OPG抑制破骨細胞及其前體融合的調(diào)控機理101-115
• 1 材料和方法101-103
• 1.1 實驗細胞株101-102
• 1.2 主要儀器102
• 1.3 主要化學(xué)試劑102
• 1.4 細胞培養(yǎng)及處理102
• 1.5 xCelligence系統(tǒng)檢測生長曲線變化102
• 1.6 破骨細胞TRAP染色及計數(shù)102
• 1.7 免疫熒光及激光共聚焦檢測融合相關(guān)因子的分布102-103
• 1.8 免疫印跡法檢測融合相關(guān)因子的表達103
• 1.9 數(shù)據(jù)分析103
• 2 結(jié)果103-110
• 2.1 OPG對破骨細胞分化融合的影響103-105
• 2.2 OPG對破骨細胞及其前體融合相關(guān)蛋白表達的影響105-106
• 2.3 OPG對融合相關(guān)因子在細胞中分布的影響106-109
• 2.4 ATP對OPG調(diào)控破骨細胞及其前體融合相關(guān)因子表達的影響109-110
• 3 討論110-112
• 參考文獻112-115
• 全文結(jié)論115-116
• 致謝116-117
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文117-118

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本文編號：292843