RNA酶促共價研究,尤其是6-甲基腺嘌呤(m6A),開啟了RNA生物學研究的一個新領域。m6A修飾是真核生物mRNA內部序列中最常見的一種轉錄后修飾形式,是一個由甲基化酶復合物(METTL3, METTL14, WTAP等)和去甲基化酶(FTO, ALKBH5等)共同調控的動態(tài)可逆過程,主要發(fā)生在RRACH (R=purine, H=A, C或U)的保守基序上,但不能排除其他基序的存在。RNA m6A轉錄后修飾具有重要的功能,而特定的"reader"蛋白可以專一識別并引導它們行使相應的功能,包括影響mRNA的出核、轉運、翻譯、降解和可變剪切等。高通量測序技術結合免疫沉淀方法的MeRIP-seq (m6A-seq)技術使全基因組范圍內深入地研究m6A的分布和功能等變得可行,然而用于分析大規(guī)模m6A測序數(shù)據(jù)的方法和軟件相對匱乏。鑒于此,本論文的研究內容主要包括兩個方面：一是首次研究并開發(fā)了簡單易用的m6A測序數(shù)據(jù)分析軟件包MeRIP-PF;二是采用MeRIP-PF技術,首次開展了水稻多組織RNA m6A修飾譜的繪制與比較研究。MeRIP-PF是一款專門針對MeRIP-seq數(shù)據(jù),快速鑒定m6A修飾區(qū)域的數(shù)據(jù)分析軟件,其基本原理是通過比較對照樣品和IP樣品測序數(shù)據(jù)在基因組/轉錄本上的分布,經統(tǒng)計檢驗,鑒定m6A的修飾區(qū)域,具體為首先將對照和IP樣品的測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組上,并統(tǒng)計每個分割窗口(Bin=25bp)的讀段數(shù)；然后通過比較每個窗口讀段數(shù)的分布計算顯著性差異的p值和FDR值：最后,FDR≤0.05作為區(qū)分可信的m6A修飾區(qū)域與背景區(qū)域的判定值。MeRIP-PF還提供了基因層次和peak層次的注釋信息,主要包括peak的大小、位置、甲基化程度等,同時對部分結果進行了圖示化展示,如所有peak在轉錄組水平的分布特征、測序讀段在基因各個注釋位置的分布特征、單個修飾基因peak的展示以及peak的甲基化程度與基因表達豐度的相關性。MeRIP-PF采用Perl語言編寫,已發(fā)布在http://software.big.ac.cn/MeRIP-PF.html網站,用戶可免費下載使用。借助MeRIP-seq技術,我們首次開展了水稻不同組織(愈傷組織、葉片組織以及4個不同萌發(fā)時間點的種胚)RNA m6A甲基化修飾譜的比較研究。首先,分別從mRNA、基因和染色體水平揭示了水稻m6A修飾的分布特征：(1)m6A在mRNA上的分布與哺乳動物(如人、小鼠等)類似,主要分布在CDS區(qū)和3’UTR區(qū)；(2) m6A peak在單個基因上的分布存在較大差異,平均每個基因攜帶兩個m6A修飾位點,關聯(lián)分析顯示基因上peak的不等分布與修飾基因的基因結構特征(外顯子數(shù)目、基因全長和內含子長度等)及基因表達水平相關；(3) m6A peak傾向于分布在染色體兩端的端粒區(qū),而越靠近著絲粒區(qū)peak密度越低,即呈現(xiàn)一個"2-terminal hot"的分布特征,此外,m6A peak在不同染色體上的分布密度也不盡相同,我們推測其密度可能與染色質的狀態(tài)和構象密切相關。其次,通過比較水稻愈傷組織和葉片組織的m6A修飾譜,分別發(fā)現(xiàn)了626和5,509個SMGs(Selectively m6A-Modified Gene)并探索了可能的機制。功能分析發(fā)現(xiàn)兩個組織的SMGs分別主要富集在轉錄調控相關的功能類和與光合作用密切相關的功能類中。進一步與已知RBP結合motif的比較發(fā)現(xiàn),葉片組織的SMGs中富集的保守序列UGUAMM (M=A|C),與PUM蛋白結合RNA的基序非常類似,而水稻基因組中6個PUM家族基因在葉片組織中呈現(xiàn)全部下調或者接近不表達的狀態(tài)。據(jù)此我們提出了競爭結合的模型,即細胞中某些RBP(如PUM)的表達會阻礙甲基化酶與RNA的結合從而阻礙m6A修飾的生成,而相反如果這些RBP在某一特定組織或某一組織的特定時期中為極低表達或不表達狀態(tài),m6A甲基化酶就可以在無阻力的情況下進入甲基化修飾的區(qū)域行使功能,從而造成了這些特定組織或特定時期樣品中選擇性甲基化基因的出現(xiàn)。最后,我們在不同萌發(fā)時間點種胚的轉錄組和甲基化組數(shù)據(jù)的分析中發(fā)現(xiàn),眾多萌發(fā)早期關鍵調控基因(激素類代謝相關的基因、貯藏蛋白、LEA蛋白等)的m6A水平都發(fā)生了顯著變化,提示m6A可能參與水稻早期萌發(fā)過程的調控。綜上所述,本研究工作中我們首次研發(fā)了簡單易用的m6A測序數(shù)據(jù)分析流程包MeRIP-PF,用于快速分析大規(guī)模m6A測序數(shù)據(jù),并采用MeRIP-seq測序技術,開展了水稻多組織RNA m6A修飾譜的比較研究,彌補了m6A在植物尤其是水稻中的研究空白,為水稻的RNA表觀修飾研究奠定了基礎。
【學位單位】：中國科學院北京基因組研究所
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S511
【文章目錄】：
致謝
摘要
ABSTRACT
專業(yè)詞匯中英文對照表
1 引言
    1.1 RNA修飾
    1.2 m6A的發(fā)現(xiàn)及研究歷程
        1.2.1 m6A的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 m6A研究的里程碑事件
    1.3 m6A甲基化/去甲基化及修飾后的調節(jié)
        1.3.1 m6A甲基化/去甲基化的動態(tài)可逆過程
        1.3.2 METTL3
        1.3.3 其他相關基因的研究
    1.4 m6A分布特點及motif研究
        1.4.1 m6A的組織分布特點
        1.4.2 m6A的基因組分布特點
        1.4.3 m6A保守序列的研究
    1.5 m6A生物學功能
    1.6 m6A檢測方法及IP-seq技術概述
        1.6.1 MeRIP-seq技術的實驗原理
        1.6.2 MeRIP-seq技術的數(shù)據(jù)分析方法
        1.6.3 單核苷酸分辨率定量檢測m6A水平
    1.7 調控種子早期萌發(fā)相關基因與機制的研究概述
        1.7.1 種子萌發(fā)
        1.7.2 調控種子早期發(fā)育的相關基因與機制的概述
    1.8 研究內容與研究意義
2 材料與方法
    2.1 實驗樣品
    2.2 實驗試劑與耗材
    2.3 MeRIP-seq實驗方法
        2.3.1 RNA-seq文庫構建
6A抗體的免疫沉淀反應'>        2.3.2 基于抗m⁶A抗體的免疫沉淀反應
    2.4 數(shù)據(jù)分析方法
        2.4.1 原始數(shù)據(jù)的質量評估及預處理
        2.4.2 有效測序數(shù)據(jù)的序列比對
        2.4.3 基因定量、差異表達分析及聚類分析
        2.4.4 特定基因的功能分析
        2.4.5 m6A peak的定量及差異分析
        2.4.6 m6A保守序列的搜索與鑒定
3 結果與討論
    3.1 甲基化區(qū)域的鑒定方法--MeRIP-PF的研發(fā)
        3.1.1 MeRIP-PF方法的原理
        3.1.2 MeRIP-PF性能測試
        3.1.3 MeRIP-PF與最新方法的比較
    3.2 水稻m6A甲基化修飾譜的基本特征
        3.2.1 6個樣品的測序數(shù)據(jù)（IP+Input）的基本情況
        3.2.2 水稻中m6A peak的鑒定
        3.2.3 水稻中m6A peak的分布特征
        3.2.4 m6A peak與基因特征、基因表達的關系
    3.3 SMG的鑒定及其機制的探索
        3.3.1 SMG的定義
        3.3.2 SMG的鑒定與功能分析
        3.3.3 SMG相關機制的探索
    3.4 水稻種子萌發(fā)早期基因表達與m6A修飾的關系
        3.4.1 種子萌發(fā)早期的共表達基因的聚類分析
        3.4.2 共表達基因的功能分析
        3.4.3 種子萌發(fā)早期重要調控基因m6A的動態(tài)變化
4 結論
參考文獻
附錄A
附錄B
作者簡介及在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 李語麗;于軍;宋述慧;;RNA中6-甲基腺嘌呤的研究進展[J];遺傳;2013年12期

2 Yuli Li;Shuhui Song;Cuiping Li;Jun Yu;;MeRIP-PF:An Easy-to-use Pipeline for High-resolution Peak-finding in MeRIP-Seq Data[J];Genomics, Proteomics & Bioinformatics;2013年01期

本文編號：2856184