大白菜(Brassica campestris ssp. pekinensis (Lour) Olsson)屬于十字花科蕓薹屬A基因組,是我國(guó)廣泛栽培的重要蔬菜作物。隨著大白菜基因組序列信息的釋放,其基因組學(xué)研究進(jìn)入了功能基因組時(shí)代。鑒于突變體是植物功能基因組學(xué)研究的理想材料,本項(xiàng)研究以大白菜小孢子DH系‘FT’為試材,將游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)與人工誘變相結(jié)合,建立了一種快速創(chuàng)制純合突變體的新方法；以創(chuàng)制的大白菜突變體為試材,利用分子標(biāo)記、基因定位以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等方法,開(kāi)展功能基因組學(xué)研究。主要研究結(jié)果如下：1.游離小孢子培養(yǎng)結(jié)合60Co-γ射線誘變處理,快速創(chuàng)制出5份大白菜純合突變體用60Co-γ射線(20、40、60 Gy)誘變處理小孢子發(fā)育處于單核靠邊期的花蕾,再?gòu)幕ɡ僦蟹蛛x小孢子進(jìn)行培養(yǎng),在獲得的1,483株小孢子再生植株中,鑒定出467株變異植株。經(jīng)M1代鑒定,篩選出5份突變體材料,突變率為0.34%。與野生型DH系'FT’相比,突變體材料分別表現(xiàn)出花瓣退化、生育遲緩、雄性不育、葉片黃化和不結(jié)球等特征性狀。2.游離小孢子培養(yǎng)結(jié)合EMS(甲基磺酸乙酯)誘變處理,快速創(chuàng)制出7份大白菜純合突變體用EMS (0.04%,0.08%,0.12%)誘變處理分離純化后的小孢子,再進(jìn)行小孢子培養(yǎng),獲得1,304株小孢子再生植株。經(jīng)Mo和M1代鑒定,篩選出7份突變體材料,突變率為0.46%。與野生型DH系‘FT’相比,突變體材料分別表現(xiàn)出雌性不育、早抽薹、生長(zhǎng)緩慢、葉片黃化和葉球變長(zhǎng)等特征性狀。3.利用分子標(biāo)記和RNA-Seq技術(shù),對(duì)花瓣退化突變基因pdm進(jìn)行精細(xì)定位和候選基因預(yù)測(cè)花瓣退化突變體pdm的表現(xiàn)特征是花瓣皺縮不開(kāi)展。遺傳分析結(jié)果表明,該突變性狀由一對(duì)隱性核基因控制。構(gòu)建F2分離群體,選取1,419株表現(xiàn)突變性狀的隱性純合體作為定位群體,將突變基因pdm定位在A01染色體的Indelhsn26和SSRhsn123兩個(gè)標(biāo)記之間,遺傳距離各為0.04 cM,物理距離約為285.2 kb。經(jīng)與大白菜參考基因組序列比對(duì),在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)共有28個(gè)基因。基于野生型‘FT’與突變體pdm的比較轉(zhuǎn)錄組分析,預(yù)測(cè)Bra040093為突變基因pdm的候選基因.Bra040093編碼過(guò)氧化物酶�；o酶A氧化酶1(ACX1),參與茉莉酸生物合成。該基因在野生型‘FT’與突變體pdm之間有2個(gè)SNPs差異。qRT-PCR分析結(jié)果表明,Bra040093在野生型'FT’中的表達(dá)量顯著高于突變體pdm。4.利用RNA-Seq技術(shù),篩選到與生育遲緩?fù)蛔凅wdrm表型相關(guān)的差異表達(dá)基因生育遲緩?fù)蛔凅wdrm的表現(xiàn)特征是生長(zhǎng)發(fā)育緩慢,葉球較小,苗期伴有輕度的葉片黃化。遺傳分析結(jié)果表明,該突變性狀由一對(duì)隱性核基因控制。與野生型‘FT’相比,突變體drm葉片的葉綠素含量明顯降低、葉綠體結(jié)構(gòu)異常、光合速率下降、葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)生變化。利用RNA-Seq技術(shù),對(duì)野生型‘FT’與突變體drm的葉片進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析,共檢測(cè)到338個(gè)差異表達(dá)基因。經(jīng)GO和KEGG pathway分析,篩選到一些參與葉綠素降解和光合作用的差異表達(dá)基因,包括葉綠素酶(chlorophyllase)和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase; Rubisco)。選取與葉綠素降解和光合作用相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR分析,推測(cè)突變基因drm可能阻礙了葉綠素生物合成和葉綠體發(fā)育,進(jìn)而影響植株的生長(zhǎng)和發(fā)育。5.利用RNA-Seq技術(shù),篩選到與雌性不育突變體fsm表型相關(guān)的差異表達(dá)基因雌性不育突變體fsm的表現(xiàn)特征是雌蕊敗育,但是雄蕊正�？捎�,其它花器官表型也發(fā)生了較大變異。遺傳分析結(jié)果表明,該突變性狀由一對(duì)隱性核基因控制。與野生型‘FT’相比,突變體fsm的胚珠發(fā)育異常。利用RNA-Seq技術(shù),對(duì)野生型‘FT’和突變體fsm的花蕾進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析,共檢測(cè)到1,872個(gè)差異表達(dá)基因。經(jīng)GO和KEGG pathway分析,篩選到一些參與胚珠發(fā)育的差異表達(dá)基因,包括PRETTY FEW SEEDS 2 (PFS2)和溫度誘導(dǎo)的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(temperature-induced lipocalin; TIL),同時(shí)鑒定出多個(gè)與花發(fā)育和開(kāi)花相關(guān)的基因。利用qRT-PCR技術(shù),分析了其中的18個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)模式,包括2個(gè)與胚珠發(fā)育相關(guān)的基因和16個(gè)與花發(fā)育和開(kāi)花相關(guān)的基因,推測(cè)突變基因fsm可能影響了胚珠的發(fā)育,使之不能完成正常的受精過(guò)程。
【學(xué)位單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S634.1
【部分圖文】：

西閣團(tuán)??跑麵畫??圖２－２?Ｍｏ代篩選出的變異檀株特征??Ｆｉｇ．?２－２?Ｍｕｔａｎｔ?ｃｈａｒａｃ化ｒｉｓｔｉｃｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?Ｍ〇?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ??ａ：白化苗；ｂ：葉片邊緣銀齒；ｃ：葉片（野生型）；ｄ：花瓣黃色（右）和野生型；ｅ－ｆ：花瓣數(shù)目變異；ｇ：桂頭外露（輕，??左）；ｈ：柱頭外露（重）；ｉ：柱頭外露（輕，中），柱頭外露（重，右）和野生型??ａ：?Ａ化ｉｎｏ?ｐｌａｎｔｌｅｔｓ；?ｂ：?Ｊａｇｇｅｄ?ｌｅａｆ?ｂｌａｄｅｓ；?Ｃ：?Ｌｅａｆ?ｂｌａｄｅｓ?（ｗｉｌｄ?ｔｙｐｅ）：?ｄ：?Ｙｅｌｌｏｗ?ｐｅｔａｌｓ?（ｒｉｇｈｔ）?ａｎｄ?ｗＵｄ?ｔｙｐｅ；?ｅ＿ｆ：?Ｖａｒｉａｂｌｅ??ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｐｅｔａｌｓ：?ｇ：?Ｓｌｉｇｈｔ?ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ?（ｌｅｆｔ）；?ｈ：?Ｓｅｖｅｒｅ?ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ；?ｉ：?Ｓｌｉｇｈｔ?ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ?（ｍｉｄｄｌｅ），?ｓｅｖｅｒｅ??ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ?（ｒｉｇｈｔ）?ａｎｄ?ｗｉｌｄ?ｔｙｐｅ??２．２．３突變體的特征特性??（１）葉片突變體??在Ｍｌ代，僅鑒定出１株葉片突變體，突變頻率為０．０７％。與野生型‘ＦＴ’相比，突??變體在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期中均表現(xiàn)為葉片黃化（圖２－扣），而且花序（圖２－化）和種芙??（圖２－３Ｃ）也表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定此突變體為二倍體。??圖２－３?Ｍ｜代鑒定出的葉片突變材料??Ｆｉｇ．?２－３?Ｌｅａｆ?ｍｕｔａｎｔ??ａ：葉片黃化突變體（左）和野生型（右）；ｂ：葉片黃化突變體的花序（右

西閣團(tuán)??跑麵畫??圖２－２?Ｍｏ代篩選出的變異檀株特征??Ｆｉｇ．?２－２?Ｍｕｔａｎｔ?ｃｈａｒａｃ化ｒｉｓｔｉｃｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?Ｍ〇?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ??ａ：白化苗；ｂ：葉片邊緣銀齒；ｃ：葉片（野生型）；ｄ：花瓣黃色（右）和野生型；ｅ－ｆ：花瓣數(shù)目變異；ｇ：桂頭外露（輕，??左）；ｈ：柱頭外露（重）；ｉ：柱頭外露（輕，中），柱頭外露（重，右）和野生型??ａ：?Ａ化ｉｎｏ?ｐｌａｎｔｌｅｔｓ；?ｂ：?Ｊａｇｇｅｄ?ｌｅａｆ?ｂｌａｄｅｓ；?Ｃ：?Ｌｅａｆ?ｂｌａｄｅｓ?（ｗｉｌｄ?ｔｙｐｅ）：?ｄ：?Ｙｅｌｌｏｗ?ｐｅｔａｌｓ?（ｒｉｇｈｔ）?ａｎｄ?ｗＵｄ?ｔｙｐｅ；?ｅ＿ｆ：?Ｖａｒｉａｂｌｅ??ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｐｅｔａｌｓ：?ｇ：?Ｓｌｉｇｈｔ?ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ?（ｌｅｆｔ）；?ｈ：?Ｓｅｖｅｒｅ?ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ；?ｉ：?Ｓｌｉｇｈｔ?ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ?（ｍｉｄｄｌｅ），?ｓｅｖｅｒｅ??ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ?（ｒｉｇｈｔ）?ａｎｄ?ｗｉｌｄ?ｔｙｐｅ??２．２．３突變體的特征特性??（１）葉片突變體??在Ｍｌ代，僅鑒定出１株葉片突變體，突變頻率為０．０７％。與野生型‘ＦＴ’相比，突??變體在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期中均表現(xiàn)為葉片黃化（圖２－扣），而且花序（圖２－化）和種芙??（圖２－３Ｃ）也表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定此突變體為二倍體。??圖２－３?Ｍ｜代鑒定出的葉片突變材料??Ｆｉｇ．?２－３?Ｌｅａｆ?ｍｕｔａｎｔ??ａ：葉片黃化突變體（左）和野生型（右）；ｂ：葉片黃化突變體的花序（右

西閣團(tuán)??跑麵畫??圖２－２?Ｍｏ代篩選出的變異檀株特征??Ｆｉｇ．?２－２?Ｍｕｔａｎｔ?ｃｈａｒａｃ化ｒｉｓｔｉｃｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?Ｍ〇?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ??ａ：白化苗；ｂ：葉片邊緣銀齒；ｃ：葉片（野生型）；ｄ：花瓣黃色（右）和野生型；ｅ－ｆ：花瓣數(shù)目變異；ｇ：桂頭外露（輕，??左）；ｈ：柱頭外露（重）；ｉ：柱頭外露（輕，中），柱頭外露（重，右）和野生型??ａ：?Ａ化ｉｎｏ?ｐｌａｎｔｌｅｔｓ；?ｂ：?Ｊａｇｇｅｄ?ｌｅａｆ?ｂｌａｄｅｓ；?Ｃ：?Ｌｅａｆ?ｂｌａｄｅｓ?（ｗｉｌｄ?ｔｙｐｅ）：?ｄ：?Ｙｅｌｌｏｗ?ｐｅｔａｌｓ?（ｒｉｇｈｔ）?ａｎｄ?ｗＵｄ?ｔｙｐｅ；?ｅ＿ｆ：?Ｖａｒｉａｂｌｅ??ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｐｅｔａｌｓ：?ｇ：?Ｓｌｉｇｈｔ?ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ?（ｌｅｆｔ）；?ｈ：?Ｓｅｖｅｒｅ?ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ；?ｉ：?Ｓｌｉｇｈｔ?ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ?（ｍｉｄｄｌｅ），?ｓｅｖｅｒｅ??ｓｔｉｇｍａ?ｅｘｐｏｓｕｒｅ?（ｒｉｇｈｔ）?ａｎｄ?ｗｉｌｄ?ｔｙｐｅ??２．２．３突變體的特征特性??（１）葉片突變體??在Ｍｌ代，僅鑒定出１株葉片突變體，突變頻率為０．０７％。與野生型‘ＦＴ’相比，突??變體在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期中均表現(xiàn)為葉片黃化（圖２－扣），而且花序（圖２－化）和種芙??（圖２－３Ｃ）也表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定此突變體為二倍體。??圖２－３?Ｍ｜代鑒定出的葉片突變材料??Ｆｉｇ．?２－３?Ｌｅａｆ?ｍｕｔａｎｔ??ａ：葉片黃化突變體（左）和野生型（右）；ｂ：葉片黃化突變體的花序（右
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