位于血管壁中膜的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)在維持血管內(nèi)環(huán)境、血壓、損傷應(yīng)答中起著至關(guān)重要的作用。VSMC表型轉(zhuǎn)換、增殖和遷移是動脈粥樣硬化、血管成形術(shù)以及PCI術(shù)后再狹窄等血管重塑性疾病的共同病理學基礎(chǔ)。闡明VSMC表型轉(zhuǎn)化機制對防治血管重塑性疾病具有重要意義。表觀遺傳學調(diào)節(jié)在VSMC表型調(diào)制中發(fā)揮重要作用。既往研究已經(jīng)證明,全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)通過誘導VSMC標志基因啟動子周圍的組蛋白H4乙酰化和組蛋白H3K4二甲基化(H3K4dime),從而促進VSMC基因表達及細胞分化。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)CBP和p300通過催化組蛋白乙�；鴮е氯旧|(zhì)去穩(wěn)定與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子一起共同激活VSMC標志基因表達。我室前期研究已經(jīng)證明,p300對ATRA誘導VSMC分化和組蛋白乙酰化是必需的,但目前尚不清楚p300如何定位到VSMC標志基因的啟動子上。Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)屬于含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員,主要參與細胞增殖、分化、凋亡、細胞周期以及胚胎發(fā)育等的調(diào)節(jié)。前期研究發(fā)現(xiàn),KLF4在VSMC分化中發(fā)揮重要作用。KLF4的N端含有較強的轉(zhuǎn)錄激活域,能募集CBP/p300到靶基因,如小腸堿性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase,IAP)特定的DNA結(jié)合位點,促進組蛋白乙�；Ｈ欢�,KLF4能否將p300募集到VSMC標志基因啟動子中的KLF4結(jié)合位點上并使周圍的組蛋白乙�；壳吧写U明。為了闡明KLF4是否可以募集p300并進而介導組蛋白乙�；约捌浞肿訖C制,本研究用轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)誘導VSMC分化,探索KLF4與p300、PTEN等蛋白因子相互作用及其翻譯后修飾的變化,研究KLF4與組蛋白乙�；g的關(guān)系,從表觀遺傳學角度揭示VSMC表型調(diào)制及分化的新機制。第一部分KLF4介導TGF-β1誘導的組蛋白H3乙�；康�:觀察TGF-β1是否促進組蛋白乙酰化,以及KLF4在組蛋白乙�；兴鸬淖饔谩７椒�:Western blot檢測組蛋白H3和H4的乙�；�;細胞免疫熒光觀察TGF-β1對組蛋白H3和H4乙酰化的影響;Ch IP法檢測乙�；疕3、p300和KLF4在p21、TβRI啟動子上的富集。結(jié)果：1 TGF-β1促進組蛋白H3、H4乙�；M蛋白乙酰化與基因轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān),TGF-β1調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞分化和細胞周期相關(guān)基因的表達。Western blot結(jié)果和細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,給予TGF-β1孵育細胞不同濃度(0、1、2、4 ng/m L)和不同時間(0、3、6、12、24 h),組蛋白H3和H4的乙�；皆龈摺＾D(zhuǎn)錄因子KLF4的表達也與TGF-β1刺激呈時間和劑量依賴性的增加。2 KLF4介導TGF-β1誘導的組蛋白H3乙酰化分別用Ad-KLF4和si-KLF4轉(zhuǎn)染VSMC,在VSMC中過表達KLF4或敲低KLF4的基礎(chǔ)上,檢測TGF-β1對H3和H4乙�；挠绊憽estern blot分析結(jié)果顯示,過表達KLF4后,組蛋白H3的乙�；矫黠@升高,TGF-β1處理進一步促進H3的乙酰化。敲低內(nèi)源性KLF4后,組蛋白H3的乙酰化水平降低,TGF-β1對H3的乙�；讲辉佼a(chǎn)生影響;但組蛋白H4的乙�；讲皇躃LF4過表達或敲低的影響。結(jié)果表明,KLF4是TGF-β1誘導組蛋白乙�；仨毜�。3 KLF4促進乙�；徒M蛋白在分化相關(guān)基因啟動子區(qū)域富集p21是KLF4的靶基因,KLF4激活p21基因表達是否與p21啟動子周圍的組蛋白乙酰化有關(guān)呢?為了明確這一問題,我們以p21基因啟動子作為研究對象,用染色質(zhì)免疫沉淀(Ch IP)分析KLF4與組蛋白乙�；年P(guān)系。我們分別用KLF4腺病毒表達載體或靶向敲低KLF4的si RNA轉(zhuǎn)染VSMC,給予或不給予TGF-β1刺激12 h。Ch IP結(jié)果顯示,在過表達KLF4的細胞中,乙酰化型H3水平在1.5 kb的p21啟動子區(qū)域均有不同程度的增高,但以-645bp到+57 bp區(qū)域乙�；虷3富集較為明顯,-227 bp/+57 bp區(qū)域乙酰化型H3的富集程度最大。這一區(qū)域含有KLF4的結(jié)合位點。在敲低KLF4的細胞中,該區(qū)域乙�；虷3的富集程度降低。這些結(jié)果表明,KLF4介導組蛋白H3的乙�；⒋龠M乙酰化H3在p21啟動子區(qū)域的富集。4 KLF4促進p300在分化相關(guān)基因啟動子區(qū)域富集Ch IP實驗結(jié)果顯示,TGF-β1增強p300在p21啟動子區(qū)域的結(jié)合,其結(jié)合位點主要定位于-645 bp/-397 bp和-225 bp/57 bp區(qū)域,這兩個區(qū)域分別包含Smad和KLF4的結(jié)合位點。進一步研究發(fā)現(xiàn),p300結(jié)合受KLF4的調(diào)節(jié),在過表達KLF4的基礎(chǔ)上,再用TGF-β1刺激細胞12 h,p300在這兩個區(qū)域的結(jié)合進一步增加。靶向敲低KLF4后,p300在此區(qū)域的富集降低。結(jié)果表明,KLF4可以將p300募集到轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上發(fā)揮組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶的作用。小結(jié)：KLF4可以將p300募集到VSMC分化相關(guān)基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上,并促進TGF-β1誘導的組蛋白H3乙�；５诙糠謕300、PTEN通過與KLF4相互作用,影響其乙酰化及磷酸化目的:檢測TGF-β1是否影響KLF4與乙酰化酶p300、磷酸酶PTEN的相互作用。觀察p300、PTEN對KLF4修飾狀態(tài)的影響。方法:免疫共沉淀檢測KLF4與p300、PTEN的相互作用;細胞免疫熒光觀察TGF-β1是否誘導KLF4和p300入核;Sequential-Ch IP法檢測p300和KLF4在p21啟動子上的結(jié)合方式;GST pull-down體外驗證KLF4與p300、PTEN的相互作用。結(jié)果：1 TGF-β1促進KLF4與p300的相互作用,抑制KLF4與PTEN的相互作用免疫共沉淀和GST pull-down實驗結(jié)果顯示,TGF-β1刺激VSMC 30min,KLF4與p300的結(jié)合達到高峰,在60 min時基本降到基礎(chǔ)水平。同時發(fā)現(xiàn),在基礎(chǔ)水平上,KLF4與PTEN結(jié)合形成復合物,TGF-β1刺激導致KLF4與PTEN的解離。在TGF-β1刺激細胞30 min時,兩者的結(jié)合降到最低,60 min時,KLF4和PTEN的結(jié)合恢復到基礎(chǔ)水平。以上結(jié)果表明,TGF-β1促進KLF4和p300的相互作用,抑制KLF4與PTEN的相互作用。2 TGF-β1促進KLF4和p300入核后結(jié)合到p21啟動子上細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,在靜止的VSMC中,KLF4在胞漿胞核均有分布,但以胞漿居多。TGF-β1刺激30 min后,KLF4出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位,幾乎完全定位于細胞核中。p300和KLF4的變化趨勢一致。說明KLF4與p300很有可能在TGF-β1刺激下,共同入核發(fā)揮作用。我們進一步進行了sequential Ch IP實驗,結(jié)果顯示,TGF-β1刺激后,KLF4-p300復合物結(jié)合到p21啟動子的-225 bp/57 bp區(qū)域。KLF4腺病毒表達載體感染VSMC,進一步增加p21啟動子的-225 bp/57 bp區(qū)域KLF4與p300的相互作用。綜上所述,在TGF-β1作用下,KLF4通過與p300相互作用,將其募集到p21等分化基因啟動子區(qū)域的KLF4結(jié)合位點上。3 TGF-β1誘導KLF4磷酸化和乙�；庖叱恋斫Y(jié)果顯示,在TGF-β1作用下,KLF4的磷酸化水平增高,在30 min時達到高峰,60 min基本恢復到基礎(chǔ)水平。在相同實驗條件下,KLF4的乙�；揭喑蕰r間依賴性增加,在45 min達到高峰,TGF-β1作用60min仍維持在較高水平上。4 p300和PTEN影響KLF4的乙�；土姿峄捎趐300和PTEN均能與KLF4相互作用,那么p300和PTEN是否影響KLF4的乙酰化和磷酸化呢?利用靶向敲低p300的si RNA轉(zhuǎn)染VSMC,免疫沉淀結(jié)果顯示,p300可使KLF4乙�；�。分別用GFP-PTEN和si-PTEN轉(zhuǎn)染VSMC,在VSMC中過表達或敲低PTEN的基礎(chǔ)上,檢測TGF-β1對KLF4磷酸化的影響。免疫沉淀結(jié)果顯示,過表達PTEN后,KLF4磷酸化水平顯著被抑制,TGF-β1不再能促進KLF4磷酸化。敲低內(nèi)源性PTEN后,KLF4磷酸化水平增高,TGF-β1處理可進一步增加KLF4的磷酸化水平。同時,我們利用VMSC特異性缺失PTEN的小鼠,取其主動脈,提取總蛋白進行免疫沉淀。結(jié)果顯示,PTEN-/-小鼠主動脈中KLF4的磷酸化水平明顯高于WT小鼠。上述結(jié)果從正反兩方面證明,PTEN可以直接去磷酸化KLF4。小結(jié)：在基礎(chǔ)水平上,PTEN與KLF4形成復合物抑制KLF4的磷酸化,TGF-β1刺激后,PTEN與KLF4解離,PTEN不再能去磷酸化KLF4,進而KLF4轉(zhuǎn)為與p300相互作用,將募集p300到p21等分化相關(guān)基因的啟動子KLF4結(jié)合位點上。第三部分磷酸化型KLF4通過p38信號通路影響p300乙�；�,進而介導組蛋白H3乙酰化目的:研究KLF4的磷酸化修飾是否參與組蛋白H3的乙�；白饔脵C制。方法:轉(zhuǎn)染KLF4磷酸化、乙酰化位點突變體表達質(zhì)粒,觀察與KLF4相互作用的相關(guān)蛋白的修飾狀態(tài)的改變;Western blot檢測相關(guān)信號通路的變化;si RNA轉(zhuǎn)染實驗用于在VSMC中敲低KLF4;免疫沉淀實驗檢測KLF4磷酸化和乙�；癄顟B(tài)的變化。結(jié)果：1 KLF4磷酸化影響其與p300的相互作用及自身的乙�；捌谘芯孔C明,TGF-β1通過激活Smad和p38 MAPK信號通路促進KLF4的Ser470殘基磷酸化,從而影響KLF4與Smad的相互作用,那么KLF4Ser470磷酸化是否影響KLF4與p300的相互作用。我們分別用KLF4表達質(zhì)粒GFP-KLF4和KLF4絲氨酸位點突變體(S470A)表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,并進行免疫共沉淀實驗。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染GFP-KLF4(S470A)表達質(zhì)粒后,KLF4的Ser470的位點不能被磷酸化,即使給予TGF-β1刺激,KLF4與p300的相互作用也處于較低水平。而KLF4與PTEN不受影響,給予TGF-β1刺激后兩者還是處于解離狀態(tài)。在相同實驗條件下,我們檢測KLF4的乙酰化狀態(tài)是否發(fā)生變化。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染KLF4突變體(S470A)后,給予TGF-β1孵育細胞30 min,KLF4的乙酰化水平與GFP-KLF4(WT)轉(zhuǎn)染+TGF-β1組相比顯著下降。轉(zhuǎn)染KLF4乙�；稽c的突變體表達質(zhì)粒(K225R、K229R和K225/229R)48 h后,給予TGF-β1刺激30 min,結(jié)果顯示,KLF4的磷酸化水平與KLF4(WT)+TGF-β1組相比沒有明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明,VSMC被TGF-β1刺激后,KLF4發(fā)生磷酸化在前,乙�；诤�;磷酸化型KLF4影響KLF4與p300相互作用,但不影響KLF4與PTEN的相互作用,這意味著KLF4與PTEN的解離在先,KLF4與p300相互作用在后。2 KLF4的磷酸化影響組蛋白H3乙�；鲜鼋Y(jié)果顯示,過表達KLF4可增加組蛋白H3的乙酰化水平,那么是否KLF4的磷酸化也影響組蛋白乙�；�?我們分別用KLF4(WT)、KLF4(S470A)、KLF4(K225R)、KLF4(K229R)和KLF4(K225/229R)表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,Western blot分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染KLF4(WT)后,給予TGF-β1孵育12 h,組蛋白H3的乙�；矫黠@增高,在KLF4(S470A)轉(zhuǎn)染+TGF-β1處理的細胞中,乙酰化型H3水平明顯降低。但是KLF4(K225R)+TGF-β1、KLF4(K229R)+TGF-β1和KLF4(K225/229R)+TGF-β1組的乙�；�?jīng)]有受到影響。我們也檢測了p300對組蛋白H3乙�；挠绊�,用p300乙酰化酶抑制劑Garcinol孵育細胞后,乙�；虷3水平顯著降低。這些結(jié)果表明,KLF4磷酸化對組蛋白H3乙�；挠绊懞苡锌赡苁峭ㄟ^募集p300來實現(xiàn)的的。3 KLF4磷酸化影響p300乙�；疻estern blot分析結(jié)果顯示,TGF-β1作用于細胞15 min,PTEN的磷酸化顯著增加,在30 min達到高峰,60 min后PTEN的磷酸化恢復到基礎(chǔ)水平,與KLF4的磷酸化變化趨勢一致。在相同實驗條件下,我們也檢測了p300乙�；揎棤顟B(tài)的變化。結(jié)果顯示,TGF-β1刺激使p300乙�；匠蕰r間依賴性增加,與KLF4的乙酰化變化趨勢一致。那么KLF4磷酸化是否影響p300乙酰化呢?轉(zhuǎn)染KLF4(WT)后,給予TGF-β1孵育30 min,PTEN的磷酸化和p300乙�；骄龈�,KLF4(S470A)+TGF-β1使p300的乙�；矫黠@降低,對PTEN的磷酸化沒有影響。而KLF4(K225R)+TGF-β1、KLF4(K229R)+TGF-β1和KLF4(K225/229R)+TGF-β1處理對p300乙酰化沒有影響。可見,KLF4的磷酸化會正反饋調(diào)節(jié)p300的乙�；健�4 Smad和p38信號通路影響p300與KLF4的修飾狀態(tài)我們進一步檢測了TGF-β1對有關(guān)信號通路的影響。用TGF-β1刺激給予VSMC不同時間(0、15、30、45、60 min),提取總蛋白進行Western blot分析。結(jié)果顯示,TGF-β1可以誘導p38、JNK、Smad2和Akt的快速磷酸化,而ERK的磷酸化水平降低。同時,而各組細胞中p38、JNK、Smad2、Akt和ERK的總量沒有發(fā)生變化。在給予TGF-β1處理細胞之前,用上述信號通路的特異性抑制劑預孵育細胞2 h,經(jīng)免疫沉淀和Western blot分析各蛋白的翻譯后修飾狀態(tài)的改變。結(jié)果顯示,TGF-β1通過p38 MAPK和Akt信號通路影響PTEN的磷酸化;通過Smad和p38 MAPK信號通路影響KLF4的磷酸化、乙酰化和p300的乙�；ＷC實TGF-β1通過Smad和p38 MAPK信號通路誘導KLF4磷酸化是p300乙�；匦璧摹�5 KLF4通過p38信號通路影響p300乙�；覀円矙z測了KLF4影響p300乙酰化的信號通路。Western blot結(jié)果顯示,KLF4過表達可增加p38的磷酸化,但是不影響Smad的磷酸化水平。敲低KLF4可以部分抑制p38的磷酸化。這就從正反兩方面證明了,KLF4可能通過p38信號通路促進p300的乙酰化。小結(jié)：TGF-β1通過激活p38和Smad信號通路誘導KLF4磷酸化,進而促進KLF4與p300相互作用及KLF4乙酰化。同時,KLF4也可通過間接激活p38信號通路誘導p300乙酰化,進而促進組蛋白H3的乙�；＝Y(jié)論：1 KLF4可以將p300募集到VSMC分化相關(guān)基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點上,并促進介導TGF-β1誘導的組蛋白H3乙�；�2在基礎(chǔ)水平上,PTEN與KLF4形成復合物抑制KLF4的磷酸化,TGF-β1刺激后,PTEN與KLF4解離,進而KLF4轉(zhuǎn)為與p300相互作用,將募集p300到p21等分化相關(guān)基因的啟動子KLF4結(jié)合位點上。3 TGF-β1通過激活p38和Smad信號通路誘導KLF4磷酸化,進而促進KLF4與p300相互作用及KLF4乙酰化。4 KLF4也可通過間接激活p38信號通路誘導p300乙�；�,進而促進組蛋白H3的乙�；�
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮寫
引言
第一部分 KLF4介導TGF-β1誘導的組蛋白H3乙�；�
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    附圖
    討論
    小結(jié)
    參考文獻
第二部分 p300、PTEN通過與KLF4相互作用，影響其乙酰化及磷酸化
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    附圖
    討論
    小結(jié)
    參考文獻
第三部分 磷酸化型KLF4通過p38信號通路影響p300乙�；M而介導組蛋白H3乙�；�
    前言
    材料與方法
    結(jié)果
    附圖
    討論
    小結(jié)
    參考文獻
結(jié)論
綜述 表觀遺傳調(diào)控在血管重塑中作用機制的研究進展
    參考文獻
致謝
個人簡歷

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本文編號：2843669