在畜牧業(yè)生產(chǎn)中,抗生素常以飼料添加劑或治療用藥的方式飼喂動物,從而達(dá)到促進(jìn)動物生長和治療疾病的目的。然而,耐藥菌的出現(xiàn)和抗生素在畜產(chǎn)品以及環(huán)境中的殘留已成為全球性的衛(wèi)生問題。近年來,肉制品加工廠采取了一系列措施來控制危害人類健康的食源性致病菌——大腸桿菌0157:H7(Escherichia coli O157:H7)進(jìn)入食物鏈,但因誤食受該菌污染牛肉制品而致病的現(xiàn)象仍時有發(fā)生。顯然,尋找一種更有效的控制牛肉污染大腸桿菌O157：H7的方法勢在必行。本論文主要研究了四種遺傳類型噬菌體(T5,T1,T4和rV5)對牛肉污染大腸桿菌O157：H7的滅菌效果及其遺傳變異的影響,并考察了核酸染料疊氮溴化丙錠(PMA)聯(lián)用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)準(zhǔn)確評價噬菌體殺菌效果的可行性,探討和評價在牛肉加工生產(chǎn)中應(yīng)用噬菌體生物防控策略的可能性,為保障食品安全創(chuàng)建一個有效的生物防治平臺。實驗首先以大腸桿菌O157：H7 O抗原翻轉(zhuǎn)酶基因(O-antigen flippase, wzx)為指示基因,應(yīng)用PMA-qPCR方法檢測噬菌體T5-like(AKFV33).T1-like (AHP24)、T4-like(V7)和rV5-like(AHP24S)對大腸桿菌0157:H7 R508N的滅菌效果,以及對大腸桿菌O157：H7基因組DNA的降解情況。結(jié)果顯示,100μM PMA能完全結(jié)合熱滅活大腸桿菌O15:H7 DNA(7log10CFU),而不影響存活菌DNA的擴(kuò)增。病原菌經(jīng)4株噬菌體侵染后,存活菌的PMA-qPCR檢測結(jié)果顯著高于傳統(tǒng)平板計數(shù)法；且四株噬菌體對宿主DNA的降解程度差異顯著(P0.01)。本實驗首次將PMA-qPCR成功應(yīng)用于噬菌體滅菌效果的檢測,并將檢測時間由傳統(tǒng)的48h縮短為5h。實驗?zāi)M實際牛肉生產(chǎn)條件,檢測上述四種噬菌體分別在4℃、22℃和口37℃環(huán)境下對牛肉表面污染五株萘啶酸抗性大腸桿菌0157:H7(E318N, E32511,H4420N,R508N,C0281-31N)的滅菌效果,并成功應(yīng)用殺病毒劑(10mM FeSO4+15% Tea)提高檢測準(zhǔn)確性。結(jié)果如下：首先,不同噬菌體滅菌效果差異顯著(P0.001)。AKFV33在三個溫度下都呈現(xiàn)出最強的滅菌能力,最高滅菌率達(dá)99%,其次是AHP24和V7,而AHP24S滅菌效果最差。其次,溫度顯著影響噬菌體滅菌效果(P0.01)。4℃環(huán)境下,噬菌體殺菌效果最差(平均滅菌量為3.log10CFU/cm2);而在37℃時,噬菌體對大腸桿菌O157：H7的滅菌效果達(dá)到最高(平均滅菌量為3.2log10CFU/cm2),因此噬菌體對大腸桿菌O157:H7的滅菌效果隨著溫度的升高而顯著增強。第三,作用時間顯著影響噬菌體滅菌效果(P0.001)。隨著噬菌體作用時間的延長,其殺菌能力明顯提高。例如,在冷藏溫度(4℃)環(huán)境下,噬菌體對大腸桿菌的滅菌量在144h達(dá)到與37℃ 3h相當(dāng)?shù)臏缇Ч?最高為3.21og10CFU/cm2。隨后,采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型技術(shù)對在牛肉滅菌實驗中存活的120株大腸桿菌O157：H7的基因變異情況和親緣關(guān)系進(jìn)行了研究,并且通過微孔板分析法檢測了存活菌株(5株突變型和115株野生型)對四株噬菌體的易感性。PFGE結(jié)果表明五株同濃度大腸桿菌O157：H7混合液,經(jīng)四種同滴度噬菌體侵染后,存活菌株在概率上存在顯著差異。菌株E318N對四株噬菌體最易感,其次是E32511,而噬菌體對H4420N的滅菌效果最差。實驗檢出的5株突變菌株分別產(chǎn)生于AFKV33 (4/5)和V7(1/5)處理組,AHP24和AHP24S實驗組均未出現(xiàn)突變菌株(0/5),說明高裂解性噬菌體更易使宿主菌發(fā)生突變。然而,盡管部分大腸桿菌O157：H7產(chǎn)生了基因突變菌株,但噬菌體仍對其易感。綜上,本論文首次成功地將PMA-qPCR方法應(yīng)用于對噬菌體滅菌效果的準(zhǔn)確檢測,證明了噬菌體有效控制牛肉污染大腸桿菌0157:H7的可行性,初步揭示了不同遺傳類型噬菌體對大腸桿菌O157：H7產(chǎn)生基因突變的影響,為噬菌體篩選和牛肉滅菌策略的商業(yè)化實施提供了可靠的事實依據(jù)和理論支持。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.6
【部分圖文】：

物質(zhì)從及外殼蛋白的合成；（４）裝配，將合成產(chǎn)物組裝成新的病毒粒子；（５）逡逑裂解與釋放，嗟菌體裂解細(xì)菌，釋放子代枿菌體，開始新的溶菌周期。生活逡逑周期見圖１。Ｔ５作為枿菌體中研究較為清楚的一種

圖４邋ＰＭＡ結(jié)合巧苗ＤＮＡ逡逑Ｆｉｇ．４邋Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ＤＮＡ邋ｂｙ邋ＰＭＡ逡逑

２．邋４．邋８隘菌體對宿主ＤＮＡ的降解逡逑理論上，ｎｏｎ－ＰＭＡ－ｑＰＣＲ結(jié)果為存活菌和死菌的總和，應(yīng)接近接種量，但逡逑實際檢測結(jié)果卻比接種量下降了邋１？２１ｏｇｉ，，ＣＦＵ邋（圖１１），表明唆菌體在裂解逡逑細(xì)菌的同時，可能將部分細(xì)菌的ＤＮＡ裂解，且降解位點位于（ＴＺＸ基因，阻斷逡逑了該基因擴(kuò)增。從圖中可Ｗ看出，唆菌體對宿主ＤＮＡ邋（確切的說是基因）逡逑的降解程度差異顯著，表現(xiàn)為ＡＨＰ２４＞ＡＦＫＶ３３（／Ｘ０．邋０１）〉ＡＨＰ２４Ｓ＞Ｖ７（b6＜０．０１）。逡逑２．邋５討論逡逑２．５．邋１關(guān)于實驗設(shè)計的討論逡逑近年來，隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌抗藥性問題層出不窮，科學(xué)家們逡逑再次將病原茵的治療轉(zhuǎn)向隆茵體，因此，作為實踐應(yīng)用的前提，評價和篩選逡逑高效枿菌體成為當(dāng)務(wù)之急。傳統(tǒng)的評價幢菌體滅菌效果的平板計數(shù)法不能有逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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1 程孝連;何澤民;孟憲春;郭倩;;蚌埠地區(qū)2000～2010年腸出血性大腸桿菌O157:H7感染狀況的研究[J];安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2012年01期

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本文編號：2821838