【摘要】：全世界有40%左右的人口受到瘧疾的威脅,目前治療瘧疾的一線藥物首選青蒿素(WHO推薦)。黃花蒿(Artemisia annua L.)屬菊科草本植物,俗名青蒿,在我國(guó)已有二千多年的藥用歷史,是提取青蒿素的唯一原料藥材。我國(guó)黃花蒿種植面積和青蒿素產(chǎn)量占全世界的90%以上。其中,重慶市三峽庫(kù)區(qū)是全國(guó)黃花蒿的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū),種植面積和青蒿素產(chǎn)量分別占全國(guó)的70%和80%,是當(dāng)?shù)氐闹饕?jīng)濟(jì)作物。黃花蒿在生長(zhǎng)過(guò)程中,主要通過(guò)殘?bào)w腐解、雨水淋溶和根系分泌等途徑向土壤生態(tài)系統(tǒng)釋放青蒿素類化感物質(zhì),降低土地生產(chǎn)力,造成周?chē)秃蟛缱魑餃p產(chǎn)。微生物是土壤的重要成分,驅(qū)動(dòng)土壤生物化學(xué)反應(yīng),如有機(jī)質(zhì)礦化,毒素降解和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與供應(yīng)等。因此,探討黃花蒿種植對(duì)土壤微生物的影響,對(duì)于科學(xué)評(píng)估黃花蒿種植造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn),減輕其對(duì)后茬作物的危害,保持土地生產(chǎn)力有重要意義。論文作者首先采用野外調(diào)查和田間試驗(yàn)方法,利用常規(guī)分析、Illumina MiSeq高通量測(cè)序和GC-MS手段,分析了野生和栽培黃花蒿土壤的理化性質(zhì)和微生物特性,以及青蒿素類物質(zhì)的含量分布；接著采用培養(yǎng)試驗(yàn),將磷脂脂肪酸(PLFAs)圖譜法和454高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合,探究了黃花蒿凋落物或青蒿素對(duì)土壤微生物群落組成及多樣性的影響,并獲得了對(duì)青蒿素敏感的功能菌,如根瘤菌、自生固氮菌和外生菌根真菌等；然后研究青蒿素對(duì)這些菌株的化感效應(yīng)。主要研究結(jié)果如下：1野生黃花蒿根區(qū)土壤中的青蒿素、黃酮含量及微生物數(shù)量野生黃花蒿現(xiàn)蕾期,植株葉片青蒿素含量最高,且現(xiàn)蕾期葉片生物量開(kāi)始顯著下降,盛花期降幅達(dá)到55.13%。各生育期葉片和根區(qū)土壤青蒿素含量的變化趨勢(shì)為：現(xiàn)蕾期始花期盛花期營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期；根區(qū)土壤中的去氧青蒿素含量最高,青蒿酸次之,青蒿素最低,三者合計(jì)516.93μg·kg-1干土,且根表和根際含量顯著高于非根際。野生黃花蒿植株黃酮含量呈現(xiàn)出莖葉根系花,根區(qū)土壤黃酮含量表現(xiàn)為根表根際非根際,且盛花期土壤黃酮含量最高,達(dá)到434.77 μg·kg-1干土。根區(qū)土壤青蒿素含量與細(xì)菌和放線菌數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.508*和r=-0.478*,n=24),去氧青蒿素含量與放線菌數(shù)量呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.528**,n=24),但黃酮和青蒿酸含量與細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量均未達(dá)到顯著相關(guān)。表明土壤中的青蒿素類物質(zhì)是抑制微生物生長(zhǎng)繁殖的主要化感物質(zhì)。2栽培黃花蒿對(duì)土壤酶活性和微生物群落的影響隨黃花蒿栽培年限增加,土壤微生物生物量碳氮、pH值、脫氫酶和脲酶活性、細(xì)菌16S rRNA序列數(shù)(Reads)均顯著降低。新地栽培黃花蒿,土壤中子囊菌門(mén)相對(duì)豐度增至95.28%,真菌ITS序列數(shù)(Reads)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)明顯增加,但細(xì)菌和真菌種類(OTUs)、豐富度指數(shù)(Ace和Chao)和多樣性指數(shù)均顯著下降；持續(xù)栽培黃花蒿(3-5年),土壤真菌ITS序列數(shù)下降,并檢測(cè)到蒿屬的常見(jiàn)病菌—蒿白粉菌和艾菊柄銹菌。主成分分析(PCA)和微生物屬水平上的聚類分析表明,栽培年限不同,黃花蒿土壤微生物群落組成差異顯著(P0.05)；在栽培黃花蒿的土壤中,前20種優(yōu)勢(shì)真菌有14種與非種植黃花蒿的土壤相同,細(xì)菌僅有5種一致。說(shuō)明黃花蒿栽培惡化土壤環(huán)境,降低土壤微生物和種群數(shù),改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu),導(dǎo)致土壤真菌化和微生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單化,增加植物性病害發(fā)生幾率。3黃花蒿凋落物／青蒿素對(duì)土壤微生物群落組成及多樣性的影響在土壤中分別添加黃花蒿凋落物和青蒿素后,真菌數(shù)量增加,但放線菌、自生固氮菌、硝化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌的數(shù)量顯著減少,土壤呼吸強(qiáng)度和微生物熵降低,代謝熵增大,說(shuō)明土壤微生物代謝受到干擾,活性降低。此外,黃花蒿凋落物和青蒿素顯著降低土壤微生物標(biāo)記性磷脂脂肪酸(PLFAs)總量和種類、以及細(xì)菌、放線菌和原生動(dòng)物的PFLAs,由PFLAs計(jì)算獲得的微生物多樣性和均勻度指數(shù)也顯著降低。454高通量測(cè)序獲得的16S rRNA序列數(shù)表現(xiàn)為對(duì)照(不加凋落物和青蒿素的土壤)(9135)黃花蒿凋落物處理(7343)≈青蒿素處理(7512),表明黃花蒿凋落物和青蒿素抑制土壤細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。三種處理中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)差異顯著,青蒿素顯著降低細(xì)菌種類(OTUs)、多樣性和均勻度指數(shù)。在青蒿素處理中,藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)的豐富度降低97.50%,前20種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌僅有13種與對(duì)照相同,且浮霉菌、根瘤菌、放線菌和酸微菌等土壤有益微生物缺失。因此,黃花蒿釋放的化感物質(zhì)尤其是青蒿素干擾土壤微生物的生長(zhǎng)、代謝及功能,改變它們的群落組成,減少種群數(shù),降低密度。4青蒿素對(duì)根瘤菌的化感效應(yīng)青蒿素極顯著的抑制快、慢生根瘤菌的繁殖,在培養(yǎng)液中加入40 mg-L-1青蒿素培養(yǎng)8 h,根瘤菌的數(shù)目不到正常培養(yǎng)的一半。隨著青蒿素濃度的增加,根瘤菌對(duì)蔗糖和葡萄糖的利用速率、胞外蛋白酶、酸性磷酸酶和固氮酶活性均顯著降低,且固氮酶活性(y)與培養(yǎng)基中的青蒿素濃度(x)可用y= e-ax+b表示(x=48 mg·L-時(shí),y≈0)。因此,青蒿素抑制根瘤菌的生長(zhǎng)繁殖、根瘤形成和生物固氮,可能降低豆科作物氮素的供應(yīng),阻礙其生長(zhǎng)發(fā)育,造成減產(chǎn)。5 青蒿素對(duì)自生固氮菌的化感效應(yīng)青蒿素顯著抑制自生固氮菌繁殖生長(zhǎng),減少檸檬酸分泌量,增加蘋(píng)果酸的分泌量,加快H+的分泌速率,在80 mg·L-1青蒿素的培養(yǎng)基中,自生固氮菌的H+分泌速率分別比對(duì)照(不加青蒿素)增加了1.61倍(Ab 09)和1.03倍(Ab 10)。胞外蛋白酶和固氮酶活性隨青蒿素濃度增加而降低,當(dāng)青蒿素濃度達(dá)到48 mg·L-1時(shí),未檢測(cè)出自生固氮菌的固氮酶活性。因此,在種植黃花蒿的土壤中,青蒿素會(huì)干擾自生固氮菌的生長(zhǎng)繁殖及固氮、溶磷、解鉀等功能。6 青蒿素對(duì)外生菌根真菌的化感效應(yīng)在液體培養(yǎng)基中加入青蒿素,外生菌根真菌菌絲的生長(zhǎng)受到明顯抑制。當(dāng)培養(yǎng)液中青蒿素的濃度達(dá)到25 mg·L-1時(shí),與對(duì)照(不加青蒿素)相比,菌絲的生物量分別下降了78.62%(S. luteus 1),96.75%(S. luteus 13),77.78%(S. luteus 11)和86.81% (S.subluteus 12)、且隨青蒿素濃度的增加,外生菌根真菌菌絲H+和草酸的分泌量顯著下降,不利于土壤磷、鉀、鈣、鎂等礦質(zhì)元素的活化；但草酸的分泌速率加快,表明青蒿素對(duì)外生菌根真菌的細(xì)胞膜有破壞作用,增加膜透性。此外,培養(yǎng)液中的青蒿素顯著地抑制了外生菌根真菌對(duì)氮、磷、鉀養(yǎng)分的吸收。當(dāng)培養(yǎng)基中青蒿素的濃度達(dá)到25 mg·L-1時(shí),S.luteus 13、S. luteus 11和S.subluteus12不再吸收氮、磷、鉀。說(shuō)明青蒿素能不同程度地抑制外生菌根真菌的生長(zhǎng)和養(yǎng)分吸收。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S567.219;S154.3
【參考文獻(xiàn)】
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本文編號(hào)：
2794732
