【摘要】：類胡蘿卜素為以多個(gè)共軛的碳碳雙鍵為生色系骨架的脂肪族或脂環(huán)族類型化合物,是由植物和微生物合成的一大類色素,因具有多種醫(yī)學(xué)生物學(xué)功能而廣受關(guān)注。西瓜(Citrullus lanatus)屬于大眾化水果之一,瓜瓤所具有的紅、粉紅、黃、白等瓤色是由類胡蘿卜素組成與含量的差異所致的,研究西瓜類胡蘿卜素生物合成積累代謝,并進(jìn)行遺傳操作,探討其抗腫瘤作用,可為西瓜類胡蘿卜素的開發(fā)利用,進(jìn)行西瓜營養(yǎng)育種和種質(zhì)創(chuàng)新提供依據(jù)。本課題從基因水平上分析西瓜果實(shí)類胡蘿卜素合成代謝的調(diào)控機(jī)制,并建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系,試圖通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對西瓜果實(shí)類胡蘿卜素的成分進(jìn)行改良。此外,本課題還對番茄紅素和β-胡蘿卜素抗腫瘤作用的分子機(jī)制進(jìn)行研究。主要內(nèi)容如下:利用RT-PCR和RACE技術(shù)從西瓜果實(shí)中分離獲得r{牛兒基r{牛兒基焦磷酸合成酶基因GGPS和八氫番茄紅素合成酶基因PSY的c DNA全長序列,并通過生物信息學(xué)方法對其核酸及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,(1)西瓜GGPS基因c DNA序列全長1,445 bp(Gen Bank登錄號(hào):KF914758),開放閱讀框?yàn)?,092 bp,編碼363個(gè)氨基酸,預(yù)測蛋白分子量約39 k Da。西瓜GGPS氨基酸序列與同為葫蘆科的甜瓜和黃瓜GGPS的同源性高達(dá)96%和95%。預(yù)測GGPS蛋白N末端存在一段52位氨基酸組成的轉(zhuǎn)運(yùn)肽信號(hào)序列。(2)西瓜PSY基因c DNA序列全長1,561 bp(Gen Bank登錄號(hào):KC166870),開放閱讀框?yàn)?,266 bp,編碼421個(gè)氨基酸,預(yù)測蛋白分子量約47.3 k Da。西瓜PSY氨基酸序列與同為葫蘆科的甜瓜和南瓜PSY的同源性分別高達(dá)95%和94%。預(yù)測PSY蛋白N末端存在一段43位氨基酸組成的轉(zhuǎn)運(yùn)肽信號(hào)序列,轉(zhuǎn)運(yùn)肽剪切后的PSY蛋白第209-231位氨基酸為一跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。種植四種不同瓤色的西瓜:紅瓤“CN66”、粉瓤“CN62”、黃瓤“ZXG381”和白瓤“ZXG507”,采摘收集各發(fā)育和成熟時(shí)期(授粉后6天、12天、18天、24天、30天、36天)的果實(shí)樣品,利用HPLC法檢測類胡蘿卜素的組成和含量,通過RT-q PCR技術(shù)分析類胡蘿卜素代謝相關(guān)酶基因(GGPS,PSY,PSY-A,PDS,ZDS,CRTISO,LCYB,CHYB,ZEP,NCED1,NCED2和NCED3)的表達(dá)。結(jié)果顯示,紅瓤“CN66”和粉瓤“CN62”成熟果實(shí)中主要含番茄紅素,以及少量的八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、δ-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素和紫黃質(zhì)。其中,番茄紅素在12 DAP時(shí)出現(xiàn),在此后的發(fā)育時(shí)期,其含量逐漸增加并成為主要的類胡蘿卜素。在18-30 DAP期間,“CN66”中大多數(shù)類胡蘿卜素合成酶基因(包括GGPS)的表達(dá)量大幅增高,而代謝酶基因NCED1和NCED2的表達(dá)量較低,導(dǎo)致該時(shí)期類胡蘿卜素的大量積累;黃瓤“ZXG381”中主要含葉黃素和紫黃質(zhì),并且在果實(shí)發(fā)育和成熟過程中,其二者含量分別與CHYB和ZEP基因的表達(dá)量呈正相關(guān);在白瓤“ZXG507”果實(shí)發(fā)育過程中,始終只能檢測到痕量的葉黃素和紫黃質(zhì),主要?dú)w因于類胡蘿卜素合成酶基因(尤其GGPS)的表達(dá)量較低,而代謝酶基因NCED1則保持較高的表達(dá)量。該結(jié)果表明,類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,對不同瓤色西瓜果實(shí)中類胡蘿卜素的組成和含量具有十分重要的影響。分別構(gòu)建由西瓜果實(shí)特異性AGPL1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)類胡蘿卜素合成相關(guān)酶基因(GGPS,PSY,LCYB)的植物表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。建立西瓜品種“紅一號(hào)”的子葉體外再生體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系,試圖將GGPS基因轉(zhuǎn)化西瓜。結(jié)果顯示,(1)以3 d齡的無菌苗子葉為外植體,接種至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 1 mg/L+IAA 0.2 mg/L中,獲得的誘導(dǎo)率最高;最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L。(2)不定芽誘導(dǎo)階段的卡那霉素篩選濃度為75 mg/L,生根階段的篩選濃度為40 mg/L。氨芐青霉素濃度為200 mg/L或頭孢霉素濃度為300 mg/L時(shí),對外植體的生長無明顯影響,可用于農(nóng)桿菌侵染后的脫菌和抑菌過程。外植體經(jīng)預(yù)培養(yǎng)2 d,用OD600值0.5的農(nóng)桿菌EHA105(轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體p AGPL1-GGPS)菌液浸染10 min,再共培養(yǎng)3 d,有利于提高遺傳轉(zhuǎn)化的效率。經(jīng)PCR檢測,初步證實(shí)GGPS基因已經(jīng)導(dǎo)入西瓜植株,轉(zhuǎn)化頻率為1.33‰。利用MTT法檢測番茄紅素和β-胡蘿卜素對人食管鱗癌細(xì)胞EC109增殖的影響,通過Western Blotting技術(shù)分析上述類胡蘿卜素對PPAR?、p21WAF1/CIP1、Cyclin D1以及Cox-2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,番茄紅素和β-胡蘿卜素(5-40μM)均能顯著抑制EC109細(xì)胞增殖,其抑制程度與處理濃度和時(shí)間呈正相關(guān),即呈劑量-時(shí)間依賴效應(yīng);使用3μM GW9662(PPAR?特異性抑制劑)預(yù)處理,能夠部分減弱上述類胡蘿卜素對細(xì)胞的抑制作用;番茄紅素和β-胡蘿卜素(40μM)均能顯著促進(jìn)PPAR?和p21WAF1/CIP1表達(dá),抑制Cyclin D1和Cox-2表達(dá),而經(jīng)GW9662預(yù)處理,能夠顯著削弱上述類胡蘿卜素引起的PPAR?、p21WAF1/CIP1、Cyclin D1以及Cox-2的表達(dá)變化。該結(jié)果表明,番茄紅素和β-胡蘿卜素能通過PPARγ信號(hào)通路調(diào)控p21WAF1/CIP1和Cyclin D1的表達(dá),干涉癌細(xì)胞周期進(jìn)程,同時(shí)下調(diào)Cox-2表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮對癌細(xì)胞增殖的抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S651;Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2748866