發(fā)布時間：2020-06-25 07:31

【摘要】：近年來,人工授精技術已經(jīng)廣泛運用于家畜繁殖的生產(chǎn)實踐中。精液冷凍保存則為人工授精提供了其所需要的優(yōu)質遺傳資源。目前,在牛生產(chǎn)中,利用冷凍精液進行人工授精已經(jīng)在全世界廣泛運用。而在豬的精液冷凍上還存在一定的困難,主要原因是由于豬的精子細胞對冷凍十分敏感,容易受低溫影響而造成不可逆的損傷。豬精子在冷凍保存后的精子活力、精子活率、質膜完整性、頂體完整性以及線粒體活性遠遠低于新鮮精液。同時,豬精液在冷凍后進行人工授精的受胎率以及產(chǎn)仔數(shù)均有明顯下降,這些因素極大的制約了豬冷凍精液在人工授精中的應用。為了解決豬精液冷凍過程中存在的問題,本研究采用在豬精液冷凍稀釋液中添加丹參多糖和α-硫辛酸,通過檢測冷凍保存后的精子品質、抗氧化酶活性,以及冷凍對豬精細胞凋亡相關基因表達的影響,研究丹參多糖和α-硫辛酸在豬精液冷凍保存中的作用。并將丹參多糖和α-硫辛酸進行配伍,篩選適合的冷凍稀釋液配方用于豬精液冷凍與人工授精,取得以下結果:1.在豬精液冷凍稀釋液中添加一定濃度的丹參多糖,能夠顯著提高豬精子冷凍保存后的精液品質。其中添加0.4 mg/mL丹參多糖的效果最好,其冷凍后精子活力、精子活率、質膜完整性、頂體完整性和線粒體完整性均顯著高于其他各組(P0.05),分別達到51.45%、48.17%、51.44%、48.61%和54.14%。在豬精液冷凍稀釋液中添加一定濃度的丹參多糖也能提高豬精子冷凍后多種抗氧化酶活性,添加0.2 mg/mL、0.4 mg/mL和0.6 mg/mL的丹參多糖均可以顯著提高精子凍后SOD酶活性(P0.05)。添加0.4mg/mL丹參多糖可以使精子凍后LDH、GOT和CAT酶活性明顯上升(P0.05)。添加丹參多糖對豬精子具有保護作用,其最適濃度為0.4 mg/mL。2.在豬精液冷凍稀釋液中添加一定濃度的α-硫辛酸,對提高豬精子冷凍保存后的精液品質有較好的作用。添加6.0 mg/mL的α-硫辛酸,冷凍后精子活力、精子活率、頂體完整性和線粒體完整性均顯著高于其他各組(P0.05),分別達到52.85%、50.52%、50.89%和53.87%;添加4.0 mg/mL和6.0 mg/mLα-硫辛酸可以顯著提高精子凍后質膜完整性(P0.05)。在豬精液冷凍稀釋液中添加一定濃度的α-硫辛酸對提高豬精子凍后抗氧化酶活性有積極的作用。添加4.0 mg/mL、6.0 mg/mLα-硫辛酸的SOD酶活性顯著高于其他組(P0.05)。添加4.0 mg/mL、6.0 mg/mLα-硫辛酸的GOT酶活性與其他組相比明顯升高(P0.05)。添加6.0 mg/mLα-硫辛酸組的LDH和CAT酶活性均最高(P0.05)。添加α-硫辛酸可以有效保護精子不受冷凍損傷,其最適濃度為6.0 mg/mL。3.為研究丹參多糖和α-硫辛酸在豬精液冷凍稀釋液中的相互作用,通過添加不同濃度的丹參多糖和α-硫辛酸,檢測凍后精子質量,擬獲取兩者的最佳配方。配伍組冷凍后精子活力、精子活率、質膜完整性、頂體完整性和線粒體完整性均顯著高于對照組以及單獨添加丹參多糖或α-硫辛酸組(P0.05)。在豬精液冷凍稀釋液中添加一定濃度的丹參多糖和α-硫辛酸能夠明顯提高豬精子冷凍保存后的抗氧化酶活性(P0.05)。S1A3組(0.3 mg/mL丹參多糖+7.0 mg/mLα-硫辛酸)、S2A1組(0.4 mg/mL丹參多糖+5.0 mg/mLα-硫辛酸)、S2A2組(0.4 mg/mL丹參多糖+6.0 mg/mLα-硫辛酸)和S2A3(0.4 mg/mL丹參多糖+7.0 mg/mLα-硫辛酸)組SOD酶活性顯著高于其他組(P0.05)。S1A3組、S2A1組和S2A2組對LDH酶活性有積極作用(P0.05)。S2A1組的GOT酶活性在所有組中最高(P0.05);S2A1組和S2A2組對提高CAT酶活性效果最好(P0.05)。因此,丹參多糖和α-硫辛酸配伍使用的效果要顯著優(yōu)于單獨使用(P0.05),最佳的配伍濃度為0.4mg/mL丹參多糖和5.0 mg/mLα-硫辛酸。4.通過對丹參多糖以及α-硫辛酸對調控豬精液冷凍后精子細胞凋亡和DNA損傷相關表達水平的研究。揭示,添加0.4 mg/mL丹參多糖顯著降低精子凍后GADD45BB和BAX基因的表達,上調凍后豬精子BCL-2基因的表達(P0.05)。添加0.8 mg/mL丹參多糖可以下調精子凍后SURVIVIN基因表達(P0.05)。添加4.0 mg/mL和6.0 mg/mLα-硫辛酸的GADD45BB基因的表達量明顯低于其他各組(P0.05)。添加4.0 mg/mLα-硫辛酸的BCL-2基因的表達量顯著高于其它組,6.0 mg/mL組的BAX基因的表達量在所有組中最低(P0.05)。在S1A3組和S2A1組中,凍后豬精子GADD45BB基因表達量明顯下調(P0.05),S3A1組(0.5 mg/mL丹參多糖+5.0 mg/mLα-硫辛酸)的SURVIVIN基因表達與其他組相比明顯降低。S2A1組中,BCL-2基因的表達顯著高于其他組(P0.05),S2A1組和S3A2(0.5 mg/mL丹參多糖+6.0 mg/mLα-硫辛酸)組可以明顯下調BAX基因的表達(P0.05)。添加丹參多糖和α-硫辛酸能夠抑制精子細胞凋亡和DNA損傷,丹參多糖和α-硫辛酸配伍使用比單獨使用效果更好,其最佳配伍濃度為0.4 mg/mL丹參多糖和5.0 mg/mLα-硫辛酸。5.利用丹參多糖以及α-硫辛酸不同配伍獲得的冷凍精液進行人工授精,結果表明使用進行冷凍精液的母豬在不返情率、受胎率、分娩率以及產(chǎn)仔數(shù)均低于新鮮精液。而在冷凍精液組中,單獨添加0.4 mg/mL丹參多糖、單獨添加6.0 mg/mLα-硫辛酸以及同時添加0.4 mg/mL丹參多糖和5.0 mg/mLα-硫辛酸具有相同不返情率和受胎率,均為70%。在分娩率方面,添加0.4 mg/mLα-硫辛酸的分娩率為60%,低于其他兩個冷凍組。而在窩產(chǎn)仔數(shù)方面,配伍組具有最高的窩產(chǎn)仔數(shù)(P0.05),為9.7頭。丹參多糖和α-硫辛酸能夠提高精子冷凍保存后人工授精結果,兩者配伍使用效果更好。以上試驗結果表明,在豬精液冷凍稀釋液中添加丹參多糖和α-硫辛酸能夠抑制精子凋亡和DNA損傷,有效提高豬精子凍后品質、抗氧化酶活力以及人工授精后不返情率、受胎率、分娩率和產(chǎn)仔數(shù)。其中聯(lián)合添加0.4 mg/mL丹參多糖和5.0 mg/mLα-硫辛酸效果較佳(P0.05)。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S828
【圖文】：

圖 5-1 丹參多糖對豬冷凍精液 GADD45BB 基因表達的影響g 5-1 Effects of different concentrations of Salvia miltiorrhiza polysaccharides on the exprGADD45BB： GADD45BB 基因的相對表達量用 mean±SD 表示，不同字母表示差異顯著（P<0.te：The relative expression leves of GADD45BB are shown as mean±S.D.and values withters indicate statistically significant (P<0.05).

圖 5-2 α-硫辛酸對豬冷凍精液 GADD45BB 基因表達的影響Fig 5-2 Effects of different concentrations of alpha-lipoic acid on the expression of GADD45B注： GADD45BB 基因的相對表達量用 mean±SD 表示，不同字母表示差異顯著（P<0.05）Note：The relative expression leves of GADD45BB are shown as mean±S.D.and values with diffletters indicate statistically significant (P<0.05).

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本文編號：2729052