【摘要】：寄生線蟲給畜牧業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失并且嚴(yán)重危害人類健康,全球至少有1億人口感染了寄生線蟲。在畜牧業(yè)上僅僅捻轉(zhuǎn)血矛線蟲,就造成了全球性的數(shù)以百萬的羊感染,并且每年造成近乎100億美元的經(jīng)濟(jì)損失。目前控制寄生線蟲感染的方法僅限于化學(xué)藥物,并且過分的依賴于早期研發(fā)的數(shù)量有限的幾種藥物。由于大量,長期的使用藥物,已經(jīng)誘導(dǎo)寄生線蟲抗藥性的產(chǎn)生。由于寄生線蟲生活史復(fù)雜,宿主多樣并且具有逃避宿主免疫的機(jī)制,使疫苗和抗寄生蟲藥物研發(fā)十分緩慢。新型藥物以及疫苗的研發(fā)需要對寄生蟲發(fā)育過程中必需基因的功能進(jìn)行深入研究。因此本研究選取了近年來報道的一類非典型蛋白激酶RIO蛋白激酶家族成員之一,RIOK-1為研究對象,以具有體外生活周期的人畜共患寄生線蟲糞類圓線蟲(Strongyloides stercoralis)為寄生線蟲模型,利用分子生物學(xué)方法和生物信息學(xué)的方法分離了糞類圓線蟲RIOK-1激酶編碼基因Ss-riok-1的c DNA及g DNA序列;分析了該激酶編碼基因在糞類圓線蟲不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平及其重組蛋白Ss-RIOK-1的體外激酶活性;利用轉(zhuǎn)基因的方法分析了Ss-riok-1在幼蟲體內(nèi)的組織學(xué)定位以及該激酶在糞類圓線蟲幼蟲發(fā)育階段的重要功能。(1)糞類圓線蟲RIOK-1編碼基因的結(jié)構(gòu)特征Ss-riok-1的c DNA全長為2056 bp,包括CDS 1524 bp,編碼507個氨基酸,5’UTR377 bp,3’UTR 155 bp。Ss-riok-1的全長基因組序列包括5’UTR,3’UTR和編碼區(qū)一共為6117 bp,其編碼區(qū)含有兩個內(nèi)含子,長度分別為134 bp和64 bp。在Ss-riok-15’UTR內(nèi)也含有兩個內(nèi)含子,大小分別為711 bp和3148 bp。Ss-riok-1的啟動子長度為4280 bp,含有真核生物常見的啟動子元件。RIOK-1激酶具有該家族保守的RIO激酶功能域,其功能域包括ATP結(jié)合區(qū);可變環(huán);鉸鏈區(qū);催化活性區(qū)和金屬離子結(jié)合區(qū)。與RIO區(qū)域的保守性不同,RIOK-1的N端和C端在不同物種間相似性較低。Ss-RIOK-1在體外具有自磷酸化和磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶通用底物牛髓磷脂蛋白的活性,并且通過突變掉催化位點(diǎn)的天冬氨酸可以使激酶喪失催化活性。(2)糞類圓線蟲RIOK-1激酶編碼基因Ss-riok-1的時空表達(dá)特征通過Ss-riok-1的轉(zhuǎn)錄水平分析,我們發(fā)現(xiàn)該基因在糞類圓線蟲的所有發(fā)育階段均有轉(zhuǎn)錄,且在感染性三期幼蟲中轉(zhuǎn)錄水平最高。Ss-riok-1在糞類圓線蟲幼蟲體內(nèi)細(xì)胞的胞質(zhì)中有明顯的表達(dá)。其表達(dá)部位主要表現(xiàn)在部分皮下細(xì)胞以及神經(jīng)元細(xì)胞中,主要包括頭部神經(jīng)元,尾部神經(jīng)元以及部分軀體運(yùn)動神經(jīng)元。Ss-riok-1的表達(dá)形式隨著幼蟲的發(fā)育發(fā)生了變化,從剛孵化的幼蟲的全身性表達(dá)到二期幼蟲的神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最終在感染性三期幼蟲的肌肉組織中表達(dá)。(3)突變的RIOK-1影響糞類圓線蟲幼蟲的發(fā)育突變的RIOK-1激酶同樣表達(dá)在幼蟲體內(nèi)細(xì)胞的胞質(zhì)中。突變的激酶在蟲卵內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致蟲卵孵化率的下降及該寄生線蟲后自由生活階段二期幼蟲的運(yùn)動性的降低,并且造成了從后自由生活階段二期幼蟲到感染性三期幼蟲發(fā)育的缺陷,表現(xiàn)為幼蟲蛻皮的不完全和咽部結(jié)構(gòu)的不完全發(fā)育。(4)Ss-RIOK-1潛在的互作蛋白的初步驗(yàn)證根據(jù)秀麗新桿線蟲基因互作的數(shù)據(jù)庫的預(yù)測和分析,初步選擇了五個可能與Ss-RIOK-1相互作用的蛋白編碼基因Ss-lin-35、Ss-riok-2、Ss-kin-3、Ss-nob1和Ss-pno1。但是通過酵母雙雜交系統(tǒng)的驗(yàn)證證明以上基因編碼的蛋白均不與Ss-RIOK-1發(fā)生直接的相互作用。本研究首次在寄生線蟲中研究了Qg源的RIOK-1蛋白激酶的功能,使我們對RIOK-1激酶在寄生線蟲生長發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮的作用有了更深的認(rèn)識,為進(jìn)一步評估RIOK-1作為可能的藥物靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.7
【圖文】：

：Ss-riok-1 的 CDS 的擴(kuò)n of the coding sequence量標(biāo)尺；1：Ss-riok-1NA Marker; 1: Ss-riok-1達(dá)到了 66.99%。編氨基酸序列 LVHA區(qū)，如圖 4-2 顯示： V），催化活性區(qū)（Ss-RIOK-1 還具有 RG-x-[ILV]-S-T-G-K-E真核生物蛋白激酶（和天冬酰胺則非常合 ATP 的賴氨酸也白激酶家族失去了在c and Wlodawer 2004

40圖 4-2：Ss-RIOK-1 氨基酸序列與來自所選擇的物種同系物的比對分析Fig. 4-2: Alignment of Ss-RIOK-1 sequence with its homologues from selected species.圖中 α 折疊由灰色標(biāo)示，下劃線標(biāo)示 β 折疊。亞結(jié)構(gòu)域 I-XI 標(biāo)注在相應(yīng)序列的下方。功能區(qū)域標(biāo)注于序列的上方，依次為 ATP 結(jié)合區(qū)（紅色），可變環(huán)（黃色），鉸鏈區(qū)（黃色），催化活性區(qū)（紅色），金屬離子結(jié)合區(qū)（黃色）。Gray region shows Alpha-helices, Underline indicate Beta-strand. Subdomains are marked bellow thesequence. Function motif are highlitend and markerd above the sequence, including ATP-binding motif(red), flexible loop (yellow), hinge (yellow), active site (red) and metal binding loop (yellow).

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 陸曉東,單小云,徐瑞龍,湯潔婭;重度糞類圓線蟲感染致死一例報告[J];浙江臨床醫(yī)學(xué);2002年12期

2 楊文武;李聞文;曾慶仁;章潔;張娟;張祖萍;;兩例糞類圓線蟲重度感染患者的病原學(xué)診斷[J];實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2013年03期

3 李松林;糞類圓線蟲病引起高熱20例[J];中國血吸蟲病防治雜志;2001年04期

本文編號：2734597