本文關鍵詞：OsDCL1基因沉默增強水稻對稻瘟菌的基礎抗性機理，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水稻是世界上最重要的糧食作物之一。全球近一半的人口,以大米為主食。由稻瘟菌引起的稻瘟病,嚴重危害水稻生長,每年給水稻生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟損失。為適應環(huán)境的變化,抵抗外界不利因素的影響,植物在長期的進化中產(chǎn)生了兩個層次的免疫系統(tǒng)：PTI反應和ETI反應,以抵御病原菌的侵襲。 小分子RNA s是一類20-24nt、廣泛存在于真核生物中的非編碼RNA。植物niRNAs基因位于基因間隔區(qū)或內含子區(qū)域,按其合成途徑可分為miRNAs (microRNAs)口siRNAs (short interfering RNAs),由不同的RNaseⅢ-like Dicer酶合成,在基因沉默過程中發(fā)揮著重要作用。DCL1(dicer like1)基因已被證明參與miRNAs的生物合成,在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著決定性作用,而且研究報道,擬南芥的DCLl基因在植物對抗病原菌的免疫反應中起作用。本文探討了水稻OsDCL1基因在植物免疫反應中的作用,發(fā)現(xiàn)OsDCL1基因的沉默增強了水稻對稻瘟菌的基礎抗性,主要結果如下： 1. OsDCL1-RNAi突變體表型及抗瘟性分析。對不同OsDCLs基因在受到稻瘟菌侵染后的表達動態(tài)進行分析,發(fā)現(xiàn)OsDCL1基因的表達在接種稻瘟菌后呈下調趨勢,而miRl62a,作為靶標降解OsDCL1的miRNA,在受到稻瘟菌侵染后其表達卻呈現(xiàn)上升的趨勢,因此在miR162a和OsDCL1基因之間可能存在一種負向反饋調節(jié)機制。為了進一步驗證OsDCL1是否參與水稻的免疫反應,創(chuàng)制了OsDCL1沉默突變體；OsDCL1-RNAi突變體表現(xiàn)出植株矮小、葉片變窄、分蘗減少和葉綠體異位表達等,并且增強了對3個稻瘟菌有毒生理小種的廣譜抗性。對菌絲侵染的鄰近細胞進行過氧化氫積累和細胞死亡實驗也證實了OsDCL1基因的沉默激活了細胞免疫反應。同時(OsDCL1基因的沉默激活了些抗病相關基因的組成表達,11個PR基因和2個PTI相關基因OsKS4和OsNAC4均在OsDCL1-RNAi突變體中被誘導表達。對這13個基因進行稻瘟菌接種后的表達模式分析,結果呈現(xiàn)出2種變化趨勢：(1)受到稻瘟菌侵染后表達上調,在36hpi或48hpi達到峰值,而后隨著時間的推移,表達呈下調趨勢；(2)受到稻瘟菌侵染后,隨著時間的推移呈上升趨勢,直到72hpi； 2OsDCL1基因沉默引起水稻轉錄組變化和差異基因分析。通過轉錄組測序的方法,對野生型水稻Nipponbare(NPB)和OsDCL1-RNAi突變體在稻瘟菌侵染前后的基因表達進行了分析和比較。響應稻瘟菌侵染的7129個差異表達基因中,參與生物脅迫反應、信號通路、蛋白代謝和RNA調控4個通路的基因明顯被富集。以未受稻瘟菌侵染的野生型中基因表達為對照,在OsDCL1-RNAi突變體中共發(fā)現(xiàn)1318個DEGs,且超過70%的DEGs是上調的,其中大多數(shù)基因參與了生物脅迫反應和信號通路,并且,上調表達基因中與生物脅迫反應相關的主要為PR基因和細胞壁相關基因；分析還發(fā)現(xiàn)10個JA((jasmonic acid))相關基因和11個SA (salicylic acid)目關基因分別在OsDCL1-RNAi突變體中被抑制和誘導表達。采用qRT-PCR的方法,驗證差異表達基因,其結果與DEGs基本一致。同時,篩選5個差異表達的WRKY基因,構建過表達載體,獲得轉基因植株,表型分析及機理研究還在進一步實驗中。對OsDCL1-RNAi突變體中轉錄組變化的分析為更深入了解由于OsDCLl基因沉默而增強水稻的抗瘟性機制提供了更多的信息； 3. OsDCLl沉默突變體接種稻瘟菌前后差異表達miRNA分析。用高通量測序的方法,鑒定了一批與免疫反應相關的miRNAs,并用莖環(huán)RT-PCR的方法分析其中的12個niRNAs受到稻瘟菌侵染后Oh、12h、24h、36h、48h、72h的表達模式,其中5個呈下調趨勢,7個呈上調趨勢。最終篩選3個差異表達的miRNAs,采用在植物體內過量表達靶基因模擬物的方法,然后通過穩(wěn)定的遺傳轉化方法獲得過量表達niRNAs海綿的轉基因植株。重點對miRNA159a.1/b的功能缺失突變體進行了表型分析和鑒定,niiRNA159a.1/b功能缺失突變體植株矮小、種子變小、開花偏晚、對稻瘟菌的抗性提高。 綜上所述,水稻可以通過調控依賴于OsDCL1基因引起的轉錄組重排和miRNA生物合成途徑激活對抗稻瘟菌的基礎免疫反應。
【關鍵詞】：水稻 稻瘟菌 OsDCL1 抗病機理 轉錄組 miRNAs
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S435.111.41
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-16
• 表目錄16-17
• 圖目錄17-18
• 縮略詞表18-20
• 第一章 文獻綜述20-34
• 1.1 稻瘟菌侵染機制20
• 1.2 植物免疫反應機制20-24
• 1.3 參與植物免疫反應的miRNA24-32
• 1.3.1 植物內源小分子RNA24-25
• 1.3.2 植物miRNA靶基因預測25-26
• 1.3.3 miRNAs在PTI免疫反應中的作用26
• 1.3.4 miRNAs在ETI免疫反應中的作用26-28
• 1.3.5 miRNAs在水稻免疫反應中的作用28-29
• 1.3.6 參與植物免疫反應的與小RNA路徑相關的基因29-31
• 1.3.7 miRNAs在植物與病原菌拮抗過程中的作用31-32
• 1.4 轉錄組分析在研究植物免疫反應中的應用32-33
• 1.5 目的與意義33-34
• 第二章 OsDCL1-RNAi突變體表型及抗瘟性分析34-61
• 2.1 材料與方法35-47
• 2.1.1 供試植物35
• 2.1.2 菌株及克隆載體35
• 2.1.3 稻瘟菌分生孢子的準備、噴霧接種及抗性鑒定35
• 2.1.4 RNA提取35-36
• 2.1.5 cDNA第一鏈合成(TIANGENFastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒）36
• 2.1.6 半定量PCR36-37
• 2.1.7 qRT-PCR37-38
• 2.1.8 stem-loop RT-PCR38-39
• 2.1.9 RNAi載體構建39-44
• 2.1.9.1 總 RNA 提取(Tirzol 法）39
• 2.1.9.2 引物設計39-40
• 2.1.9.3 膠回收(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)40
• 2.1.9.4 克隆反應體系的建立40
• 2.1.9.5 大腸桿菌轉化40-41
• 2.1.9.6 抽提質粒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit)41
• 2.1.9.7 陽性重組子的鑒定41-42
• 2.1.9.8 酶切、膠回收42
• 2.1.9.9 pENTA-DCL1載體的構建42-43
• 2.1.9.10 LR反應43
• 2.1.9.11 農(nóng)桿菌轉化43-44
• 2.1.10 轉基因植株的獲得44-45
• 2.1.10.1 誘導愈傷組織44
• 2.1.10.2 繼代44
• 2.1.10.3 共培養(yǎng)44
• 2.1.10.4 洗愈傷44
• 2.1.10.5 分化44
• 2.1.10.6 生根44-45
• 2.1.11 病斑統(tǒng)計45
• 2.1.12 點接種45
• 2.1.13 植物基因組DNA提取(CTAB法）45-46
• 2.1.14 水稻葉鞘侵入分析46
• 2.1.15 水稻葉岕 DAB(diaminobenzidine)染色46
• 2.1.16 水稻葉鞘臺盼藍染色46-47
• 2.2 結果與分析47-58
• 2.2.1 OsDCLs基因的檢測與表達47-49
• 2.2.2 半定量RT-PCR49-50
• 2.2.3 Os-miRl62a受稻瘟菌侵染后的表達模式分析50
• 2.2.4 OsDCL1-RNAi轉基因植株的鑒定50-52
• 2.2.5 OsDCL1-RNAi突變體中不同OsDCLs基因的表達52-53
• 2.2.6 OsDCL1-RNAi突變體的表型分析53-54
• 2.2.7 OsDCL1-RNAi突變體的抗瘟性鑒定54-55
• 2.2.8 菌絲侵染實驗55-56
• 2.2.9 細胞死亡實驗56-57
• 2.2.10 OsDCL1基因的沉默激活一些抗病基因的組成型表達57-58
• 2.3 討論58-61
• 第三章 OsDCL1-RNAi轉錄組和差異基因的分析61-75
• 3.1 材料與方法62
• 3.1.1 供試材料62
• 3.1.2 載體及菌株62
• 3.1.3 轉錄組測序和分析62
• 3.1.4 qRT-PCR驗證62
• 3.2 結果與分析62-72
• 3.2.1 OsDCL1-RNAi突變體在接種稻瘟菌前后轉錄組水平的變化62-63
• 3.2.2 DEGs功能富集分析和抗病相關基因表達分析63-67
• 3.2.3 JA和SA信號通路相關基因67-68
• 3.2.4 qRT-PCR驗證和分析參與稻瘟菌免疫反應基因68-71
• 3.2.5 5個差異表達基因過表達載體的構建71-72
• 3.3 討論72-75
• 第四章 DCL1沉默突變體接種稻瘟菌前后小分子RNA和基因表達譜差異分析75-85
• 4.1 材料與方法76-78
• 4.1.1 供試植物76
• 4.1.2 載體及菌株76
• 4.1.3 miRNA測序及分析76
• 4.1.4 莖環(huán)式RT-PCR76-77
• 4.1.5 miRNA海綿設計及序列合成77-78
• 4.2 結果與分析78-83
• 4.2.1 受稻瘟菌誘導表達的miRNA78-80
• 4.2.2 miRNA159a.l/b的表型分析及抗病性鑒定80-83
• 4.3 討論83-85
• 參考文獻85-103
• 附表103-107
• 附錄Ⅰ107-114
• 附錄II114-115
• 作者簡歷115

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：OsDCL1基因沉默增強水稻對稻瘟菌的基礎抗性機理，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：261953