本文關(guān)鍵詞：OsDCL1基因沉默增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟菌的基礎(chǔ)抗性機(jī)理，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水稻是世界上最重要的糧食作物之一。全球近一半的人口,以大米為主食。由稻瘟菌引起的稻瘟病,嚴(yán)重危害水稻生長(zhǎng),每年給水稻生產(chǎn)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。為適應(yīng)環(huán)境的變化,抵抗外界不利因素的影響,植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化中產(chǎn)生了兩個(gè)層次的免疫系統(tǒng)：PTI反應(yīng)和ETI反應(yīng),以抵御病原菌的侵襲。 小分子RNA s是一類(lèi)20-24nt、廣泛存在于真核生物中的非編碼RNA。植物niRNAs基因位于基因間隔區(qū)或內(nèi)含子區(qū)域,按其合成途徑可分為miRNAs (microRNAs)口siRNAs (short interfering RNAs),由不同的RNaseⅢ-like Dicer酶合成,在基因沉默過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。DCL1(dicer like1)基因已被證明參與miRNAs的生物合成,在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著決定性作用,而且研究報(bào)道,擬南芥的DCLl基因在植物對(duì)抗病原菌的免疫反應(yīng)中起作用。本文探討了水稻OsDCL1基因在植物免疫反應(yīng)中的作用,發(fā)現(xiàn)OsDCL1基因的沉默增強(qiáng)了水稻對(duì)稻瘟菌的基礎(chǔ)抗性,主要結(jié)果如下： 1. OsDCL1-RNAi突變體表型及抗瘟性分析。對(duì)不同OsDCLs基因在受到稻瘟菌侵染后的表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)OsDCL1基因的表達(dá)在接種稻瘟菌后呈下調(diào)趨勢(shì),而miRl62a,作為靶標(biāo)降解OsDCL1的miRNA,在受到稻瘟菌侵染后其表達(dá)卻呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),因此在miR162a和OsDCL1基因之間可能存在一種負(fù)向反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證OsDCL1是否參與水稻的免疫反應(yīng),創(chuàng)制了OsDCL1沉默突變體；OsDCL1-RNAi突變體表現(xiàn)出植株矮小、葉片變窄、分蘗減少和葉綠體異位表達(dá)等,并且增強(qiáng)了對(duì)3個(gè)稻瘟菌有毒生理小種的廣譜抗性。對(duì)菌絲侵染的鄰近細(xì)胞進(jìn)行過(guò)氧化氫積累和細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了OsDCL1基因的沉默激活了細(xì)胞免疫反應(yīng)。同時(shí)(OsDCL1基因的沉默激活了些抗病相關(guān)基因的組成表達(dá),11個(gè)PR基因和2個(gè)PTI相關(guān)基因OsKS4和OsNAC4均在OsDCL1-RNAi突變體中被誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)這13個(gè)基因進(jìn)行稻瘟菌接種后的表達(dá)模式分析,結(jié)果呈現(xiàn)出2種變化趨勢(shì)：(1)受到稻瘟菌侵染后表達(dá)上調(diào),在36hpi或48hpi達(dá)到峰值,而后隨著時(shí)間的推移,表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)；(2)受到稻瘟菌侵染后,隨著時(shí)間的推移呈上升趨勢(shì),直到72hpi； 2OsDCL1基因沉默引起水稻轉(zhuǎn)錄組變化和差異基因分析。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法,對(duì)野生型水稻Nipponbare(NPB)和OsDCL1-RNAi突變體在稻瘟菌侵染前后的基因表達(dá)進(jìn)行了分析和比較。響應(yīng)稻瘟菌侵染的7129個(gè)差異表達(dá)基因中,參與生物脅迫反應(yīng)、信號(hào)通路、蛋白代謝和RNA調(diào)控4個(gè)通路的基因明顯被富集。以未受稻瘟菌侵染的野生型中基因表達(dá)為對(duì)照,在OsDCL1-RNAi突變體中共發(fā)現(xiàn)1318個(gè)DEGs,且超過(guò)70%的DEGs是上調(diào)的,其中大多數(shù)基因參與了生物脅迫反應(yīng)和信號(hào)通路,并且,上調(diào)表達(dá)基因中與生物脅迫反應(yīng)相關(guān)的主要為PR基因和細(xì)胞壁相關(guān)基因；分析還發(fā)現(xiàn)10個(gè)JA((jasmonic acid))相關(guān)基因和11個(gè)SA (salicylic acid)目關(guān)基因分別在OsDCL1-RNAi突變體中被抑制和誘導(dǎo)表達(dá)。采用qRT-PCR的方法,驗(yàn)證差異表達(dá)基因,其結(jié)果與DEGs基本一致。同時(shí),篩選5個(gè)差異表達(dá)的WRKY基因,構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體,獲得轉(zhuǎn)基因植株,表型分析及機(jī)理研究還在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中。對(duì)OsDCL1-RNAi突變體中轉(zhuǎn)錄組變化的分析為更深入了解由于OsDCLl基因沉默而增強(qiáng)水稻的抗瘟性機(jī)制提供了更多的信息； 3. OsDCLl沉默突變體接種稻瘟菌前后差異表達(dá)miRNA分析。用高通量測(cè)序的方法,鑒定了一批與免疫反應(yīng)相關(guān)的miRNAs,并用莖環(huán)RT-PCR的方法分析其中的12個(gè)niRNAs受到稻瘟菌侵染后Oh、12h、24h、36h、48h、72h的表達(dá)模式,其中5個(gè)呈下調(diào)趨勢(shì),7個(gè)呈上調(diào)趨勢(shì)。最終篩選3個(gè)差異表達(dá)的miRNAs,采用在植物體內(nèi)過(guò)量表達(dá)靶基因模擬物的方法,然后通過(guò)穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得過(guò)量表達(dá)niRNAs海綿的轉(zhuǎn)基因植株。重點(diǎn)對(duì)miRNA159a.1/b的功能缺失突變體進(jìn)行了表型分析和鑒定,niiRNA159a.1/b功能缺失突變體植株矮小、種子變小、開(kāi)花偏晚、對(duì)稻瘟菌的抗性提高。 綜上所述,水稻可以通過(guò)調(diào)控依賴(lài)于OsDCL1基因引起的轉(zhuǎn)錄組重排和miRNA生物合成途徑激活對(duì)抗稻瘟菌的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：水稻 稻瘟菌 OsDCL1 抗病機(jī)理 轉(zhuǎn)錄組 miRNAs
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S435.111.41
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-16
• 表目錄16-17
• 圖目錄17-18
• 縮略詞表18-20
• 第一章 文獻(xiàn)綜述20-34
• 1.1 稻瘟菌侵染機(jī)制20
• 1.2 植物免疫反應(yīng)機(jī)制20-24
• 1.3 參與植物免疫反應(yīng)的miRNA24-32
• 1.3.1 植物內(nèi)源小分子RNA24-25
• 1.3.2 植物miRNA靶基因預(yù)測(cè)25-26
• 1.3.3 miRNAs在PTI免疫反應(yīng)中的作用26
• 1.3.4 miRNAs在ETI免疫反應(yīng)中的作用26-28
• 1.3.5 miRNAs在水稻免疫反應(yīng)中的作用28-29
• 1.3.6 參與植物免疫反應(yīng)的與小RNA路徑相關(guān)的基因29-31
• 1.3.7 miRNAs在植物與病原菌拮抗過(guò)程中的作用31-32
• 1.4 轉(zhuǎn)錄組分析在研究植物免疫反應(yīng)中的應(yīng)用32-33
• 1.5 目的與意義33-34
• 第二章 OsDCL1-RNAi突變體表型及抗瘟性分析34-61
• 2.1 材料與方法35-47
• 2.1.1 供試植物35
• 2.1.2 菌株及克隆載體35
• 2.1.3 稻瘟菌分生孢子的準(zhǔn)備、噴霧接種及抗性鑒定35
• 2.1.4 RNA提取35-36
• 2.1.5 cDNA第一鏈合成(TIANGENFastQuantcDNA第一鏈合成試劑盒）36
• 2.1.6 半定量PCR36-37
• 2.1.7 qRT-PCR37-38
• 2.1.8 stem-loop RT-PCR38-39
• 2.1.9 RNAi載體構(gòu)建39-44
• 2.1.9.1 總 RNA 提取(Tirzol 法）39
• 2.1.9.2 引物設(shè)計(jì)39-40
• 2.1.9.3 膠回收(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)40
• 2.1.9.4 克隆反應(yīng)體系的建立40
• 2.1.9.5 大腸桿菌轉(zhuǎn)化40-41
• 2.1.9.6 抽提質(zhì)粒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit)41
• 2.1.9.7 陽(yáng)性重組子的鑒定41-42
• 2.1.9.8 酶切、膠回收42
• 2.1.9.9 pENTA-DCL1載體的構(gòu)建42-43
• 2.1.9.10 LR反應(yīng)43
• 2.1.9.11 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化43-44
• 2.1.10 轉(zhuǎn)基因植株的獲得44-45
• 2.1.10.1 誘導(dǎo)愈傷組織44
• 2.1.10.2 繼代44
• 2.1.10.3 共培養(yǎng)44
• 2.1.10.4 洗愈傷44
• 2.1.10.5 分化44
• 2.1.10.6 生根44-45
• 2.1.11 病斑統(tǒng)計(jì)45
• 2.1.12 點(diǎn)接種45
• 2.1.13 植物基因組DNA提取(CTAB法）45-46
• 2.1.14 水稻葉鞘侵入分析46
• 2.1.15 水稻葉岕 DAB(diaminobenzidine)染色46
• 2.1.16 水稻葉鞘臺(tái)盼藍(lán)染色46-47
• 2.2 結(jié)果與分析47-58
• 2.2.1 OsDCLs基因的檢測(cè)與表達(dá)47-49
• 2.2.2 半定量RT-PCR49-50
• 2.2.3 Os-miRl62a受稻瘟菌侵染后的表達(dá)模式分析50
• 2.2.4 OsDCL1-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的鑒定50-52
• 2.2.5 OsDCL1-RNAi突變體中不同OsDCLs基因的表達(dá)52-53
• 2.2.6 OsDCL1-RNAi突變體的表型分析53-54
• 2.2.7 OsDCL1-RNAi突變體的抗瘟性鑒定54-55
• 2.2.8 菌絲侵染實(shí)驗(yàn)55-56
• 2.2.9 細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)56-57
• 2.2.10 OsDCL1基因的沉默激活一些抗病基因的組成型表達(dá)57-58
• 2.3 討論58-61
• 第三章 OsDCL1-RNAi轉(zhuǎn)錄組和差異基因的分析61-75
• 3.1 材料與方法62
• 3.1.1 供試材料62
• 3.1.2 載體及菌株62
• 3.1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析62
• 3.1.4 qRT-PCR驗(yàn)證62
• 3.2 結(jié)果與分析62-72
• 3.2.1 OsDCL1-RNAi突變體在接種稻瘟菌前后轉(zhuǎn)錄組水平的變化62-63
• 3.2.2 DEGs功能富集分析和抗病相關(guān)基因表達(dá)分析63-67
• 3.2.3 JA和SA信號(hào)通路相關(guān)基因67-68
• 3.2.4 qRT-PCR驗(yàn)證和分析參與稻瘟菌免疫反應(yīng)基因68-71
• 3.2.5 5個(gè)差異表達(dá)基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建71-72
• 3.3 討論72-75
• 第四章 DCL1沉默突變體接種稻瘟菌前后小分子RNA和基因表達(dá)譜差異分析75-85
• 4.1 材料與方法76-78
• 4.1.1 供試植物76
• 4.1.2 載體及菌株76
• 4.1.3 miRNA測(cè)序及分析76
• 4.1.4 莖環(huán)式RT-PCR76-77
• 4.1.5 miRNA海綿設(shè)計(jì)及序列合成77-78
• 4.2 結(jié)果與分析78-83
• 4.2.1 受稻瘟菌誘導(dǎo)表達(dá)的miRNA78-80
• 4.2.2 miRNA159a.l/b的表型分析及抗病性鑒定80-83
• 4.3 討論83-85
• 參考文獻(xiàn)85-103
• 附表103-107
• 附錄Ⅰ107-114
• 附錄II114-115
• 作者簡(jiǎn)歷115

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：OsDCL1基因沉默增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟菌的基礎(chǔ)抗性機(jī)理，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：261953