本文關鍵詞：基于光子晶體編碼微球的農(nóng)藥多殘留檢測技術構(gòu)建與應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的：我國是農(nóng)藥生產(chǎn)與消費大國,隨著農(nóng)藥的大量和不合理地使用,農(nóng)藥殘留對人類健康、生態(tài)環(huán)境以及對外貿(mào)易造成的負面影響漸漸顯露出來,農(nóng)藥殘留通過各種可能的途徑危及食品安全、人畜安全以及生態(tài)環(huán)境等問題備受關注。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用的農(nóng)藥通過沉降、地表徑流等途徑進入環(huán)境,引起水資源污染、水生態(tài)系統(tǒng)破壞、食品安全等一系列問題。因此,為了保護人們的健康以及控制農(nóng)藥對環(huán)境的污染,發(fā)展靈敏、快速以及成本低的農(nóng)藥定量檢測技術是非常必要的。經(jīng)典的農(nóng)藥殘留儀器檢測方法包括HPLC、GC-MS、LC-MS等,雖然這些方法靈敏、可靠,但是存在儀器昂貴、需要專業(yè)的技術人員操作、樣品前處理復雜、耗時長等缺點,而且檢測過程中大量有機溶劑的使用可能引起環(huán)境污染,因此其應用受到了一定的限制。快速檢測技術是監(jiān)控農(nóng)藥殘留的有效手段,基于免疫分析的農(nóng)藥殘留檢測技術具有操作簡單、快速、靈敏度高、特異性強、檢測費用低等優(yōu)點,是當前國內(nèi)外農(nóng)藥殘留快速檢測的研究熱點,可以實現(xiàn)對農(nóng)藥殘留的快速檢測。但是,國內(nèi)外現(xiàn)有的研究主要集中于針對單一農(nóng)藥建立特異性的免疫分析方法,而實際樣品中普遍同時存在多種農(nóng)藥,建立同時檢測多種農(nóng)藥的檢測方法是擬解決的關鍵問題。與單一分析物檢測方法相比,以編碼微球作為載體的液相芯片技術具有高通量、檢測時間短、樣品用量少、檢測效率高、成本低以及可以進行多種分析物的同時檢測等優(yōu)點。因此,本研究將液相芯片技術應用于農(nóng)藥殘留檢測領域,以膠體光子晶體微球和光子晶體水凝膠復合微球作為編碼微載體,以有機磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥作為分析對象,建立了基于膠體光子晶體微球同時檢測殺螟硫磷和甲基毒死蜱的液相芯片技術和基于光子晶體水凝膠復合微球同時檢測五種有機磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥(殺螟硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷、甲萘威和速滅威)的液相芯片技術,為相關技術的應用奠定了基礎。研究內(nèi)容和結(jié)果：(1)膠體光子晶體微球的制備利用協(xié)流式玻璃微流控平臺,使用不同粒徑的二氧化硅納米粒子制備具有不同反射光譜的膠體光子晶體微球,為后續(xù)的農(nóng)藥多殘留液相芯片檢測技術提供編碼載體。(2)基于膠體光子晶體微球同時檢測殺螟硫磷和甲基毒死蜱的液相芯片技術通過將農(nóng)藥單克隆抗體偶聯(lián)于膠體光子晶體微球表面作為檢測探針,加入待檢的游離農(nóng)藥和異硫氰酸熒光素標記的農(nóng)藥抗原,采用直接競爭法,在液相反應體系中游離的農(nóng)藥和異硫氰酸熒光素標記的農(nóng)藥抗原共同競爭微球上各自特異性的農(nóng)藥單克隆抗體,待測農(nóng)藥含量越少,結(jié)合到微球表面抗體上的農(nóng)藥抗原越多,檢測時的熒光強度越高；反之,待測農(nóng)藥含量越多,結(jié)合到微球表面抗體上的農(nóng)藥抗原越少,檢測時的熒光強度越低。根據(jù)熒光強度與待檢農(nóng)藥的濃度呈一定的相關性,因此可定量檢測農(nóng)藥。經(jīng)過條件優(yōu)化后,繪制了同時檢測甲基毒死蜱和殺螟硫磷的標準曲線,線性檢測范圍分別為0.40～735.37 ng/mL和0.25-1024ng/mL,最低檢測限分別為0.25 ng/mL和0.40 ng/mL。以毒死蜱、對硫磷、甲基對硫磷、三唑磷、殺撲磷、溴硫磷、三氯吡啶酚、倍硫磷、對氧磷、氯硫磷進行交叉反應實驗,交叉反應率均小于5%,該方法對各種干擾物無明顯交叉反應,特異性良好。添加殺螟硫磷和甲基毒死蜱于空白的葡萄、萵筍以及白菜樣品中,平均添加回收率范圍分別為81.6%-92.2%和82.4%～97.3%。實驗結(jié)果表明,該方法對殺螟硫磷和甲基毒死蜱的檢測具有靈敏度高、特異性強、重現(xiàn)性好、線性范圍寬和檢測限低等優(yōu)點,可以為農(nóng)藥殘留高通量分析提供了一種快速有效的實用分析方法。(3)基于光子晶體水凝膠復合微球同時檢測五種有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的液相芯片技術以膠體光子晶體微球為基礎,制備了五種不同反射光譜的光子晶體水凝膠復合微球作為液相芯片的編碼微載體。以五種應用廣泛的有機磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥作為目標分析物,將抗原-抗體免疫反應與生物素-親和素放大體系相結(jié)合應用于農(nóng)藥殘留的檢測,實現(xiàn)了對五種農(nóng)藥殘留同時檢測的目標�；陂g接競爭免疫反應來構(gòu)建農(nóng)藥多殘留檢測方法,偶聯(lián)在微球上的農(nóng)藥抗原與目標農(nóng)藥競爭結(jié)合農(nóng)藥單克隆抗體,由于目標農(nóng)藥可以抑制大分子農(nóng)藥抗原與相應農(nóng)藥抗體的結(jié)合,當樣品中農(nóng)藥濃度增加時,由于抗原抗體的特異性識別反應,溶液中的抗原抗體免疫復合物增加,而結(jié)合到微球表面的抗體減少,形成的免疫復合物相應減少,因此檢測時,熒光強度降低。根據(jù)熒光強度與待檢農(nóng)藥的量成一定的相關性,可以定量檢測農(nóng)藥。通過一系列的優(yōu)化和篩選實驗條件(抗原、抗體加入量、反應時間等),進一步的提高了液相芯片檢測技術的靈敏度以及穩(wěn)定性。該方法檢測殺螟硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷、甲萘威和速滅威的最低檢測限分別為0.02ng/mL、0.012 ng/mL、0.04 ng/mL、0.05 ng/mL和0.10ng/mL,線性檢測范圍分別為0.02～1562.5 ng/mL、0.012～937.5 ng/mL0.04-1250 ng/mL0.05～819.2 ng/mL以及0.10～218.7 ng/mL,檢測五種農(nóng)藥標準曲線的決定系數(shù)(R2)均大于0.99,標準曲線擬合良好。選擇毒死蜱、三唑磷、對硫磷、甲基對硫磷、殺撲磷、溴硫磷、滅多威、蟲螨威、殘殺威、仲丁威以及異丙威進行交叉反應實驗,不同農(nóng)藥的交叉反應率均很低(5%),該檢測方法對農(nóng)藥干擾物無明顯交叉反應,特異性良好。本方法在蘋果、萵筍、白菜、黃瓜以及西紅柿中的添加回收率范圍分別為88.9-106.2%、82.6-106.3%、85.4-105.5%、88.7-104.3%和85.6～103.5%,在環(huán)境水樣中的添加回收率范圍為83.3%～102.2%,LC-MS/MS方法在蘋果、萵筍、白菜、黃瓜以及西紅柿中添加回收率分別為85.9%～104.3%、88.4%～105.6%、86.7%-103.6%,84.6%～102.7和85.3%-105.6%,在環(huán)境水樣中的添加回收率范圍為85.6%-95.3%,這兩種方法的添加回收實驗結(jié)果基本吻合。通過方法比對實驗,進一步確定了液相芯片檢測方法的準確性,與傳統(tǒng)的LC-MS/MS方法相比,基于光子晶體水凝膠微球的液相芯片檢測方法簡便、快速、結(jié)果穩(wěn)定可靠,能夠滿足農(nóng)產(chǎn)品以及環(huán)境水樣中痕量農(nóng)藥的檢測要求,可以作為一種簡便、快捷、高通量的檢測方法用于農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境水樣中有機磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的定量檢測。
【關鍵詞】：光子晶體 水凝膠 液相芯片 有機磷農(nóng)藥 氨基甲酸酯類農(nóng)藥
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S481.8
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 縮略詞中英文對照16-19
• 前言19-25
• 第一章 膠體光子晶體微球的制備25-34
• 1.1. 材料與方法25-29
• 1.1.1 主要實驗儀器25-26
• 1.1.2 主要實驗試劑26-27
• 1.1.3 協(xié)流式微流控平臺的搭建27-28
• 1.1.4 膠體光子晶體微球的制備28-29
• 1.2 結(jié)果29-31
• 1.2.1 膠體光子晶體微球的組裝29-31
• 1.2.2 膠體光子晶體微球的光學特性31
• 1.3 討論31-33
• 1.4 小結(jié)33-34
• 第二章 基于膠體光子晶體微球的農(nóng)藥多殘留檢測技術34-50
• 2.1 材料與方法35-38
• 2.1.1 主要實驗儀器35
• 2.1.2 主要實驗試劑35-36
• 2.1.3 方法36-38
• 2.1.3.1 農(nóng)藥抗體在膠體光子晶體微球表面的固定36-37
• 2.1.3.2 檢測條件的優(yōu)化37
• 2.1.3.3 構(gòu)建同時檢測農(nóng)藥甲基毒死蜱和殺螟硫磷的標準曲線37-38
• 2.1.3.4 方法學評價38
• 2.2 結(jié)果38-44
• 2.2.1 反應體系的優(yōu)化38-40
• 2.2.2 同時檢測農(nóng)藥甲基毒死蜱和殺螟硫磷標準曲線的繪制40-42
• 2.2.3 方法學評價42-44
• 2.3 討論44-49
• 2.4 小結(jié)49-50
• 第三章 基于光子晶體水凝膠復合微球的農(nóng)藥多殘留檢測技術50-79
• 3.1 材料與方法51-57
• 3.1.1 主要實驗儀器51
• 3.1.2 主要實驗試劑51-52
• 3.1.3 方法52-57
• 3.1.3.1 光子晶體水凝膠復合微球的制備52
• 3.1.3.2 農(nóng)藥抗原在微球表面的固定52-53
• 3.1.3.3 反應體系的優(yōu)化53-54
• 3.1.3.4 構(gòu)建同時檢測五種農(nóng)藥的標準曲線54-55
• 3.1.3.5 方法學評價55
• 3.1.3.6 環(huán)境水樣的采集及樣品前處理55
• 3.1.3.7 農(nóng)藥多殘留檢測試劑盒的初步設計55-57
• 3.2 結(jié)果57-73
• 3.2.1 水凝膠組分的優(yōu)化57-59
• 3.2.2 檢測條件的優(yōu)化59-64
• 3.2.3 同時檢測五種農(nóng)藥標準曲線的繪制64-66
• 3.2.4 方法學評價66-71
• 3.2.5 環(huán)境水樣的檢測分析71-73
• 3.3 討論73-78
• 3.4 小結(jié)78-79
• 總結(jié)79-80
• 展望80-81
• 參考文獻81-93
• 綜述93-123
• 參考文獻110-123
• 作者簡介123-125
• 致謝125-126

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