【摘要】：阿爾巴斯白絨山羊是內蒙古自治區(qū)優(yōu)良家畜品種,屬絨肉兼優(yōu)型珍稀品種,其絨毛被視為“軟黃金”,肉被視為“肉中人參”,在我國畜牧業(yè)生產中占有十分重要的地位。利用現代生物技術建立阿爾巴斯白絨山羊多能干細胞系不僅可以為相關學科的發(fā)展提供理論依據,同時在其遺傳育種方面也具有十分重要的應用價值。雖然目前對家畜干細胞的研究不斷深入,但其胚胎干細胞的建系一直未能成功。近年來隨著誘導性多潛能干細胞技術的興起,利用特定因子誘導成體細胞重編程成多潛能干細胞已成為可能。本研究將特定轉錄因子導入阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細胞,獲得阿爾巴斯白絨山羊誘導性多潛能性干細胞(giPSCs)。對giPSCs表達胚胎干細胞標記蛋白、細胞核型、體外三胚層分化的類胚體以及體內畸胎瘤形成能力進行觀察,并對giPSCs進行全基因表達譜芯片分析,進一步了解其重編程情況,探索研究其分子機制,為絨山羊胚胎干細胞的建系提供實驗依據。1 giPSCs的建系1.1 giPSCs的生成利用強力霉素(Dox)誘導性慢病毒載體,將特定干細胞多能性轉錄因子(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)轉入阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細胞(GFFs)使細胞重編程,約20d后可見小鼠胚胎干細胞樣克隆生成,即giPSCs。giPSCs呈立體狀生長,橢圓形、表面光滑、折光性強。第28d,經堿性磷酸酶(AP)染色鑒定,約80%的克隆呈陽性。1.2 giPSCs的多能性檢測免疫熒光檢測結果顯示giPSCs表達OCT4.SOX2.NANOG.SSEA-1. TRA-1-60和TRA-1-81等胚胎干細胞標志性蛋白,而不表達SSEA.3和SSEA-4。RT-PCR結果顯示giPSCs表達OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、 REX1等胚胎干細胞標記基因。giPSCs能在體外自分化形成具有三胚層分化的類胚體,經免疫熒光檢測具有外胚層標記蛋白Ⅲβ-Tubulin、中胚層標記蛋白Desmin和內胚層標記蛋白Cytokeratin的表達；giPS Cs能在體內分化形成畸胎瘤,經組織切片染色檢測具有腺體樣組織(內胚層)、肌肉組織(中胚層)和神經組織(外胚層)的分化。giSCs具有正常核型,為58+XX。2giPSCs誘導及培養(yǎng)條件的優(yōu)化2.1轉錄因子的搭配和培養(yǎng)基的優(yōu)化轉錄因子組合OSMK(將Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc組合至一個載體中)、Oct4+Sox2+Klf4+c-Myc和Oct4+Sox2+Klf4都能誘導GFFs生成giPSCs。其中OSMK病毒感染的細胞,每5×104個細胞中可獲得22.8+2.9個AP陽性克隆,克隆重編程成度高,不易分化,內源基因OCT4和NANOG高表達(P0.01)；Oct4+Sox2+Klf4+c-Myc病毒組感染的細胞,每5×104個細胞中可得23.8±2.2個AP陽性克隆,長期傳代后高代克隆易分化,克隆中內源的Sox2基因高表達(P0.01)；Oct+Sox2+Klf4病毒組感染的細胞,每5×104個細胞中只獲得5.0±1.0個AP陽性克隆,克隆中內源基因OCT4、SOx2和NANO G的表達水平低(P0.01),克隆易分化。培養(yǎng)基中逐步添加小分子化合物Vc、VPA和LiCl,統(tǒng)計每5×104個細胞中生成的giPSCs的AP陽性克隆數發(fā)現,含有Vc的培養(yǎng)基中可形成平均17.5±1.3個陽性克隆,與未添加小分子的培養(yǎng)基相比干細胞標記基因OCT4、SOX2和NANOG的表達水平顯著提高(P0.01)；含有VPA+LiCl的培養(yǎng)基中可形成平均24.8±2.1個陽性克隆,OCT4和NANOG基因的表達水平顯著提高(P0.01)；含有Vc+VPA+LiCl的培養(yǎng)基中可形成平均28.9±0.75個陽性克隆,與前兩組相比干細胞標記基因OCT4、SOX2、 NANOG的表達水平再次提高。結果表明培養(yǎng)基中添加小分子化合物Vc、VPA和LiC1能有效提高重編程效率。2.2飼養(yǎng)層和靶細胞的選擇實驗中分別選擇了昆明白小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)、絨山羊胎兒成纖維細胞(GFF)、山羊胎兒成纖維細胞和小鼠胎兒成纖維細匏1：1混合(MEF+GFF)細胞作為giPSCs的飼養(yǎng)層細胞。結果發(fā)現,giPSCs在MEF飼養(yǎng)層上的生長增殖速度比較慢,細胞暗淡,折光性差,易分化,內源基因OCT4、SOX2、NANOG的表達水平較低(P0.05)。相比于MEF飼養(yǎng)層,GFF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的giPSCs克隆質量優(yōu),克隆光滑圓潤,邊緣清晰,細胞生長速度較快。內源基因OCT4、SOX2、NANOG的表達水平高(P0.05)。MEF+GFF飼養(yǎng)層上的細胞克隆與小鼠胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的細胞克隆相似。結果表明同源的GFF飼養(yǎng)層更適合giPSCs的增殖生長。靶細胞的選擇上,本實驗誘導阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細胞(GFFs)、肺間充質干細胞(LMSCs)、骨髓間充干細胞(BMSCs)、初級毛乳頭細胞(PHFDPCs)、次級毛乳頭細胞(SHFDPCs)以及成體成纖維細胞(GEFs)均能獲得giPSCs o其中GFFs的重編程效率最高,每5×104個細胞中可形成24.7±2.1個AP陽性克�。黄浯问荘HFDPCs,每5×104個細胞中可形成20.8±1.7個AP陽性克隆,而相同條件下SHFDPCs中僅生成15.3±1.5個；兩種間充質干細胞的重編程效率低于GFFss和PHFDPCs,LMSCs每5×104個細胞中可形成17.4±1.2個AP陽性克隆,BMSCs的為18.7±2.2個；成體成纖維細胞的重編程效率較低,每5×104個細胞中只形成10.4±1.8個AP陽性克隆。證明PHFDPCs和GFFs比較適合giPSCs的重編程。3 giPSCs的全基因表達譜分析3.1 giPSCs的表達差異基因的分析全基因表達譜芯片分析giPSCs (GFF-giPSCs)、GFFs和阿爾巴斯白絨山羊類胚胎干細胞(ESCLCs)中差異基因的表達情況發(fā)現,giPSCs與GFFs的表達譜有明顯的差異,與ESCLCs的表達譜也有明顯差異。giPSCs已進入重編程,但與ESCLCs有一定差距。giPSCs中干細胞多能性相關基因已開始表達,但表達量相比于ESCLCs的較低,多能性較弱。本實驗挑選了OCT4、 SOX2、NANOG、DNMT3b、KLF5、PODXL、REX-1等20個多能性相關基因,并對比了這些基因在3組不同細胞中的表達情況。結果顯示,giPSCs中多能性基因已開始表達或基因表達量明顯上調,成纖維標志性基因明顯下調,但giPSCs中各基因的表達量低于ESCLCs中的表達。giPSCs已有多潛能特性,但相較于ESCLCs其多能性差,自我更新能力較弱。3.2 giPSCs的多能性和增殖相關信號通路的分析對所得芯片數據進行干細胞多能性和增殖相關信號通路的KEGG數據庫富集性分析結果顯示,在Wnt、MAPK、PI3K-AKT、細胞周期和DNA復制等信號通路上,giPSCs的基因表達與GFFs的基因表達有顯著差異,與ESCLCs的基因表達相似。giPSCs中MAPK和PI3K-AKT信號通路具有高活性,促進了giPSCs的多能性和自我更新。giPSCs中Wnt信號通路上的GSK3B雖高度聚集,但β-catenin的聚集仍然開啟了TCF/LEF核心轉錄途徑,促進了giPSCs的自我更新。在細胞周期信號通路和DNA復制信號通路上,giPSCs中除了CDK2、CYCA、CYCD、MCM2基因上調表達之外,MCM3、 MCM4、MCM6、MCM7、CDC20、CDK1的表達與GFFs相同,而M CM5的表達下調,表明giPS C中DNA復制活性低下,增殖速度緩慢。
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變成有另一種特定功能的細胞或全能細胞。然而，重編程并沒有明確的方向性，它也可能逡逑會引起不必要基因的激活。逡逑細胞重編程的方式主要有Ｓ種：核移植，，細胞融合Ｗ及ｉＰＳ技術（圖１．１）。這些技術逡逑可Ｗ改變特定類型細胞的命運，使這些細胞返回到類似ＥＳＣｓ的狀態(tài)。核移植技術是通過逡逑把體細胞核移植到去核的卵母細胞中來啟動體細胞中細胞核的重編程，使重編程的細胞逡逑回到受精卵的階段，得到與體細胞供體一樣的完整新個體，這一過程也稱之為克隆。個體逡逑的每個細胞都有一套完整的遺傳信息，只是細胞中的遺傳信息網絡的階段不同而己。一種逡逑細胞分化成另一種特定的細胞只是因為基因表達的改變，并非基因的組成成分發(fā)生了變逡逑化。核移植技術證明了分化進程能夠被完全的逆轉。卵母細胞或受精卵中存在完整的一套逡逑重編程相關因子【氣體細胞核移植而得到的囊胚中獲得的ＥＳＣｓ（邋ｎｕｃｌｅａｒ邋ｔｒａｎｓｆｅｒ邋ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ逡逑ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ，ｎ化ＳＣｓ）品質好，且效率高［Ｗ，然而，倫理的限制嚴重影響了其應用。逡逑細胞融合技術是指多個類型的細胞融合形成單一實體。這種技術可幫助我們研究逡逑兩個或多個基因之間的相互作用。哺郭動物的體細胞分化的狀態(tài)是可逆的，它取決于參與逡逑調控的基因的平衡性和持續(xù)性Ｌ１Ｗ７］。細胞融合技術

內源ｉＶｃｗｏｇ基因的表達，所Ｗ細胞重編程中ｉＶｗｗｇ不是必須基因。Ｘ沁２Ｓ的作用機制到目逡逑前為止知之甚少。它可能是通過穩(wěn)定ｍＲＮＡ的轉錄并組織轉錄調節(jié)網絡來促進細胞重編逡逑程［７７］。也有報道稱，Ｉ扣２Ｓ抑制細胞通過Ｌｅｔ－７依賴性途徑分化（圖１．２）邋［８２，８３］。逡逑邐Ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ｃｏｒｅ邋巨Ｓ邋ｃｅｌｌ邋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ邐逡逑ＡＣＴ邋ＩＶ巨邐爵邋ｎ芭邋ｉｐ＂0ｎ逡逑＼邋ＰＯＬ２游邐一邐ｆａｃｔ。。逡逑１＿二＾＾逡逑ＥＳ邋ｃｅｌｌ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ逡逑少邐ｕ＾ａａｉｊ逡逑Ｉ邐Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ逡逑（ｎａｎｏ＾邐—＇ＨｕＳＨ逡逑—ｉｇｇｇｇｇ逡逑邐Ｅｃｔｏｄｅｒｍ逡逑ＳＩＬＥＮＴ逡逑氣邋ＰＯＬ２邋戶S緬義�？—逦１—邋厌ｓ谚p義襄五巍停澹螅錚洌澹潁礤義希桑裕蓿媯幔幔媯悖灣危巍紓輳停桑眨懾澹懾義希穡潁椋蓿櫻蓿�！逦—匚逦Ｉ｝x齲攏攏齲齲洛澹牛悖簦錚洌澹潁恚義希懾危牛睿洌錚洌澹潁礤義希㈠危卞危牛睿洌錚洌澹潁礤義希懾危卞澹懾危牛簦潁В幔澹恚猓潁錚睿椋悖義希ⅲ螅慊義賢跡保殘∈螅牛櫻牽籩謝櫻錚蛑停粒媯澹

本文編號：2618240