本文關(guān)鍵詞：新型重組H5亞型高致病性禽流感病毒的致病性與傳播性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基因重配造成了人類(lèi)歷史上多次流感的大流行,1957年的亞洲流感就是由于當(dāng)時(shí)流行的H1N1亞型毒株從禽流感病毒中獲得了HA、NA和PB1基因；1968年的香港流感(H3N2)則是當(dāng)時(shí)H2N2亞型人流感病毒從禽流感病毒中獲得HA和PB1基因。2009年甲型H1N1流感病毒則被認(rèn)為是四源基因重排的結(jié)果,PB2和PA來(lái)源于禽流感病毒,PB1來(lái)源于1968香港H3N2人流感病毒,HA、NP和NS來(lái)源于早期流行于北美地區(qū)的H1N1豬流感病毒,而NA和M則由20世紀(jì)90年代初歐亞豬群中流行的H1N1病毒提供。2013年初在中國(guó)華東地區(qū)發(fā)生了H7N9亞型禽流感病毒感染人事件,到目前為止該病毒仍在不斷的感染人,并且引起了比較高的死亡率。該病毒是通過(guò)H7亞型的病毒與帶N9 NA基因的病毒,以及流行于我國(guó)家禽中的H9N2亞型禽流感病毒的基因重配產(chǎn)生的。高致病性禽流感(HPAI)H5N1最早于1996年從我國(guó)廣東地區(qū)的發(fā)病鵝群中分離到,其HA基因已經(jīng)進(jìn)化出Clade0-9共計(jì)10個(gè)不同的進(jìn)化分支,其中的一些分支隨著病毒的不斷進(jìn)化還出現(xiàn)了二級(jí)、三級(jí)甚至是四級(jí)亞分支。H5N1亞型HPAI由于能感染少部分人并具有高致死率,給人類(lèi)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成巨大的威脅。盡管目前H5N1高致病性禽流感病毒還沒(méi)有獲得在人與人之間高效傳播的能力,但是近年來(lái)開(kāi)始不斷的從各種家禽里分離到許多新型重組病毒,這些病毒的HA基因都來(lái)源于Gs/GD/96-like,而其它基因卻來(lái)自其它各種亞型的流感病毒。了解這些新型重組H5亞型高致病性禽流感病毒的致病性和傳播性,對(duì)于防控流感大流行具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室2010年在華東地區(qū)的活禽交易市場(chǎng)中分離到一株新型重組H5N2禽流感病毒A/chicken/Hebei/1102/2010 (HB10)。研究發(fā)現(xiàn)它的HA來(lái)源于我國(guó)流行的Clade 7.2 H5亞型禽流感病毒而其它基因來(lái)源于H9N2禽流感病毒,且HB10的內(nèi)部基因片段與H7N9流感病毒高度相似。我們推測(cè)它可能通過(guò)進(jìn)一步的基因變異獲得類(lèi)似于H7N9病毒直接感染人的能力。為了研究HB10跨種間傳播的潛在機(jī)制,我們將該病毒在小鼠肺內(nèi)連續(xù)傳代,并對(duì)傳代過(guò)程中病毒的毒力變化進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,當(dāng)將HB10病毒傳到第5代時(shí)其對(duì)小鼠的半數(shù)致死劑量(MLD50)由1070EID50下降為10485EID50,其毒力增強(qiáng)了100多倍；而傳到第15代時(shí),病毒變異為高毒力毒株。隨后,我們對(duì)第15代病毒進(jìn)行了克隆、純化,獲得一株對(duì)小鼠高毒力的鼠適應(yīng)毒HB10-MA,并對(duì)病毒HB10-MA的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,HB10-MA的MLD50為1025EID50,與HB1O相比其毒力至少高出1045倍；同時(shí)HB10-MA病毒在小鼠肺內(nèi)的增殖滴度和速度均顯著高于HB10病毒,并且HB10-MA病毒的復(fù)制部位從肺臟擴(kuò)展到了心、肝、脾、腎及腦組織,而HB10病毒僅能在肺臟中復(fù)制。與此同時(shí),HB10-MA在哺乳細(xì)胞MDCK和A549上的復(fù)制能力也明顯增強(qiáng)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),與HB10病毒相比HB10-MA在4個(gè)基因上發(fā)生了5個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變,分別為HA-S227N,PB2-Q591K, PB2-D701N, PA-V554I和NP-R351K.我們推測(cè)這些氨基酸位點(diǎn)的突變可能與新型重組H5N2禽流感病毒在小鼠肺內(nèi)傳代過(guò)程中的毒力增強(qiáng)有關(guān)。為了進(jìn)一步研究鼠適應(yīng)毒HB10-MA對(duì)小鼠致病性增強(qiáng)的分子機(jī)制,我們利用反向遺傳技術(shù)分別以HB10和HB10-MA為骨架拯救了一系列的單基因互換重組病毒,并比較了它們?cè)谛∈竽Ｐ蜕系亩玖Σ町悺Ｎ覀儼l(fā)現(xiàn)PB2、PA基因是鼠適應(yīng)毒HB10-MA的毒力增強(qiáng)的重要基因,但是PB2基因起主導(dǎo)作用。由于HB10與HB10-MA在PB2基因上僅有2個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異,因此我們拯救了PB2基因單個(gè)位點(diǎn)突變的病毒,并評(píng)價(jià)了它們?cè)谛∈笾械亩玖亩M(jìn)一步確定影響HB10-MA和HB10對(duì)小鼠毒力差異的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PB2的591K和701N兩個(gè)位點(diǎn)是導(dǎo)致鼠適應(yīng)毒高毒力的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),而且它們起著協(xié)同作用。PB2上591和701兩個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)突變能在很大程度上引起HB10和HB10-MA病毒毒力、復(fù)制能力以及聚合酶活性協(xié)同改變。因此,我們的結(jié)果表明PB2上591K和701N兩個(gè)位點(diǎn)的共同變異是使新型重組H5N2亞型禽流感病毒鼠適應(yīng)毒毒力增強(qiáng)的關(guān)鍵。PB2的627K被認(rèn)為是許多禽源和人源流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物高致病性的關(guān)鍵氨基酸。因此,我們將PB2-E627K與Q591K和D701N以單點(diǎn)、雙點(diǎn)或三點(diǎn)突變的形式引入HB10骨架,研究這些位點(diǎn)對(duì)病毒毒力的影響。首先,我們發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)的單點(diǎn)突變?cè)鰪?qiáng)了HB10對(duì)小鼠的毒力。其次,我們發(fā)現(xiàn)與單點(diǎn)突變相比,PB2-D701N與PB2-Q591K或PB2-E627K雙突變明顯增強(qiáng)病毒對(duì)小鼠的毒力。然而,PB2-Q591K與PB2-E627K雙突變雖然增強(qiáng)了病毒的體外聚合酶活性,但它們顯著致弱了病毒對(duì)小鼠的毒力。因此,我們的研究再次強(qiáng)調(diào)PB2基因在禽流感病毒適應(yīng)哺乳動(dòng)物中的關(guān)鍵作用,將有助于我們深入了解新型重組H5N2流感病毒跨種間傳播和致病的分子機(jī)制。近年來(lái)又不斷的從各種家禽里分離到了與不同的NA亞型(包括N2、N5、N6、N8)重組的新型H5高致病性禽流感病毒,并且這些病毒的HA基因均屬于Clade2.3.4變異亞分支。在這些新型重組病毒中,部分基因型已經(jīng)呈現(xiàn)流行的趨勢(shì)。最近,在一些東南亞國(guó)家相繼發(fā)生了幾次新型重組H5N6禽流感疫情且在我國(guó)發(fā)生了H5N6感染人事件,與此同時(shí)H5N8也已經(jīng)相繼在至少11個(gè)國(guó)家中爆發(fā)疫情。由于流感病毒獲得結(jié)合a-2,6唾液酸受體的能力是其在人間大流行的先決條件。因此,我們首先對(duì)這些新型重組的H5亞型高致病性禽流感病毒進(jìn)行了受體結(jié)合能力的測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有檢測(cè)的新型重組H5亞型病毒在結(jié)合α-2,3唾液酸受體的同時(shí),也獲得了α-2,6唾液酸受體的結(jié)合能力。然而受體結(jié)合特性雖然被認(rèn)為是流感病毒宿主范圍的主要因素,但是獲得了α-2,6唾液酸受體的結(jié)合能力的病毒并不一定能在人群間有效地傳播。因此,接下來(lái),我們用豚鼠模型來(lái)評(píng)價(jià)了新型重組H5亞型病毒的復(fù)制能力以及潛在的傳播能力。我們發(fā)現(xiàn)所有檢測(cè)的新型重組H5亞型病毒均能在攻毒組豚鼠體內(nèi)有效地復(fù)制,值得注意的是其中的一株H5N2(GS/EC/1112/11)和一株H5N5(031)病毒在豚鼠間具有有效地接觸傳播能力。我們的研究表明當(dāng)前流行于各個(gè)國(guó)家的此類(lèi)新型重組H5亞型病毒可能會(huì)對(duì)人類(lèi)的健康存在一定的威脅。因此,加強(qiáng)該病毒在家禽中的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、病毒分離與生物學(xué)特性分析有重要意義。為了進(jìn)一步確定影響新型重組H5亞型病毒受體結(jié)合性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),本研究,以只有α-2,3唾液酸受體的結(jié)合能力的Clade 2.3.4病毒A/mallard/Huadong/S/2005 (HD/05)為骨架,利用反向遺傳技術(shù),對(duì)差異氨基酸位點(diǎn)(共有8個(gè)氨基酸的差異)進(jìn)行定點(diǎn)突變,并評(píng)價(jià)點(diǎn)突變病毒的受體結(jié)合性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響新型重組H5亞型病毒受體結(jié)合性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)是HA的160位氨基酸,T160A的突變能導(dǎo)致HA的158糖基化位點(diǎn)缺失并使得病毒獲得α-2,6唾液酸受體的結(jié)合能力。接著我們對(duì)突變株HD-160A在豚鼠體內(nèi)的復(fù)制能力以及豚鼠間直接接觸傳播的能力進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn)HA上158糖基化位點(diǎn)的缺失的病毒不但能在豚鼠體內(nèi)有效的復(fù)制,還能在豚鼠間進(jìn)行有效地直接接觸傳播。已有研究表明HA的158位糖基化位點(diǎn)的缺失能導(dǎo)致病毒對(duì)小鼠的毒力增強(qiáng)。我們也發(fā)現(xiàn)HA上158糖基化位點(diǎn)的缺失可以導(dǎo)致病毒對(duì)小鼠的毒力增強(qiáng),同時(shí)增強(qiáng)了病毒在哺乳細(xì)胞MDCK和A549上的復(fù)制能力。因此,我們的研究表明HA的158糖基化位點(diǎn)的缺失可以作為一個(gè)分子標(biāo)記用來(lái)評(píng)價(jià)Clade 2.3.4變異亞分支H5病毒引起大流行的潛在能力。此外,HA的158位糖基化位點(diǎn)的缺失導(dǎo)致Clade 2.3.4變異亞分支H5病毒同時(shí)具備α-2,3和α-2,6受體結(jié)合性,可能對(duì)人類(lèi)和家禽都能造成危害。因此,需加強(qiáng)此類(lèi)病毒的監(jiān)測(cè)。綜上所述,我們利用高毒力的鼠適應(yīng)毒,發(fā)現(xiàn)PB2基因的變異是新型重組H5N2流感病毒跨種間傳播和毒力增強(qiáng)的關(guān)鍵因素,且進(jìn)一步確定了PB2的591K和701N兩個(gè)位點(diǎn)的共同變異是新型重組H5N2亞型禽流感病毒鼠適應(yīng)毒毒力增強(qiáng)的關(guān)鍵。同時(shí),發(fā)現(xiàn)影響新型重組H5亞型病毒受體結(jié)合性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)是病毒HA的158糖基化位點(diǎn)的缺失。我們認(rèn)為HA的158糖基化位點(diǎn)的缺失與否可以作為一個(gè)分子標(biāo)記用來(lái)評(píng)價(jià)Clade 2.3.4變異亞分支H5病毒引起大流行的潛在能力。因此,我們的研究進(jìn)一步說(shuō)明對(duì)H5亞型禽流感病毒加強(qiáng)流行病學(xué)監(jiān)測(cè)具有重要意義,是為防控流感大流行作準(zhǔn)備的重要措施。
【關(guān)鍵詞】：新型重組 H5N2禽流感病毒 鼠適應(yīng) 致病性 受體 直接接觸傳播
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-7
• 英文摘要7-12
• 符號(hào)說(shuō)明12-14
• 綜述 H5亞型禽流感病毒的致病性和傳播性研究進(jìn)展14-48
• 1. 禽流感病毒的病原學(xué)特點(diǎn)14-17
• 2. H5亞型禽流感病毒的分子流行病學(xué)17-19
• 3. 流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物致病的分子機(jī)制19-25
• 4. 流感病毒在哺乳動(dòng)物間傳播的分子機(jī)制25-31
• 參考文獻(xiàn)31-48
• 第一章 新型重組H5N2亞型高致病性禽流感病毒鼠適應(yīng)株的建立48-76
• 1. 材料與方法49-52
• 2. 結(jié)果52-66
• 3. 討論66-70
• 參考文獻(xiàn)70-76
• 第二章 鼠適應(yīng)株HB10-MA致病性相關(guān)的分子機(jī)制研究76-104
• 1. 材料與方法77-80
• 2. 結(jié)果80-94
• 3. 討論94-98
• 參考文獻(xiàn)98-104
• 第三章 新型重組H5亞型禽流感病毒受體結(jié)合性及在豚鼠間傳播性的研究104-125
• 1. 材料與方法105-108
• 2. 結(jié)果108-115
• 3. 討論115-118
• 參考文獻(xiàn)118-125
• 第四章 影響新型重組H5亞型禽流感病毒受體結(jié)合性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的確定125-148
• 1. 材料與方法126-130
• 2. 結(jié)果130-140
• 3. 討論140-142
• 參考文獻(xiàn)142-148
• 全文總結(jié)148-149
• 致謝149-150
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文150-152

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