本文關鍵詞：嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥實驗模型的構建目的:嗜水氣單胞菌是引起養(yǎng)殖魚類腸道炎癥的主要條件致病菌,其致病機理很大程度上仍不清楚。本研究旨在構建嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥模型,為加深了解細菌性腸道炎癥的致病機理提供可重復的實驗模型。方法:以不同濃度的嗜水氣單胞菌菌液經肛門灌腸感染草魚,根據炎性癥狀的疾病活動指數篩選出誘導腸道炎癥的適宜劑量。以肛門灌注2.7′106 CFU/尾嗜水氣單胞菌誘導產生腸道炎癥,采用光學顯微鏡和掃描電鏡觀察細菌感染后腸道的病理變化,測定整個實驗觀察期內的腸道組織髓過氧物酶活性,分析促炎細胞因子IL-1b、IL-8和腫瘤壞死因子a(TNF-a)的表達水平的變化。結果:組織病理學檢查顯示,嗜水氣單胞菌感染后第3天,出現腸道絨毛粘連和脫落等嚴重的腸道損傷,并伴隨嚴重的炎性細胞浸潤。超微結構觀察也顯示,細菌感染引起微絨毛脫落。在隨后18天的實驗期內,受損的程度絨毛逐漸修復。結果還顯示,嗜水氣單胞菌感染誘導的炎性應答反應與促炎細胞因子IL-1b、IL-8和TNF-a的表達以及髓過氧物酶的活性密切相關,處理后的第3天,腸道內這些細胞因子的m RNA表達和MPO活性達到最高水平。結論:嗜水氣單胞菌引起的腸道損傷以及隨后的修復與炎癥相關基因或生物標志隨時間的變化是完全一致的。因而,我們已成功構建了高密度養(yǎng)殖魚類腸道炎癥的實驗模型。該模型可望用于揭示草魚和其他養(yǎng)殖魚類細菌性腸炎的致病機制,篩選具潛在應用價值的水產養(yǎng)殖抗菌藥物。二、嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸炎的腸道轉錄組比較研究目的:草魚是一種非模式動物,其基因組信息有限,導致人們對草魚的分子免疫途徑、物質代謝模式及發(fā)育機制的了解相對缺乏。本研究旨在利用轉錄組測序策略揭示腸道組織的基因表達及嗜水氣單胞菌誘導后腸道基因表達模式的變化,從而探討嗜水氣單胞菌誘導草魚腸道炎癥的分子機制。方法:分別提取健康草魚的胸腺、頭腎、脾臟、肝臟、表皮、鰓、腸道等組織的總RNA,檢測合格后等量混合,構建c DNA文庫,利用第二代高通量測序技術進行轉錄組從頭測序。采用嗜水氣單胞菌感染草魚,從感染1 d后具明顯炎癥癥狀的草魚腸道組織中提取總RNA,并以健康魚腸道組織的總RNA為對照,測定腸道轉錄組,比較分析細菌誘導后腸道內基因的表達變化。通過GO和KEGG分析,探討差異表達基因的功能。此外,分別從誘導前以及細菌感染1 d與3 d后的腸道組織提取總RNA,通過q PCR方法檢測轉錄組測序篩選的腸道炎癥通路中差異表達基因的時序表達,進而分析炎癥相關基因與嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥的關聯性。結果:高通量測序共獲得45,867,282個總clean reads,裝配成120,964個contigs和67,413個unigenes。COG成功注釋了23,275個unigenes,分別隸屬于25個特定類群。通過GO功能注釋,鑒定出26,567個轉錄本,歸于53個功能群,分別屬于生物過程、細胞成分與分子功能3個類別。有28,386個unigenes被映射到259個KEGG通路。轉錄組比較顯示,健康對照組和嗜水氣單胞菌感染組的腸道中,共表達基因達到18,170個,差異表達的基因達549個,其中,315個上調表達,234個下調表達。按照功能類別,差異表達基因中有36.43%的基因與細胞成份相關,38.25%與基因的分子功能相關,38.99%與參與的生物過程相關。差異基因共涉及到165條通路,主要包括類風濕關節(jié)炎、抗原加工和遞呈、吞噬體、氧化磷酸化、I型糖尿病、溶酶體、核糖體通路、細胞因子及其受體的相互作用等免疫相關通路。q PCR分析結果顯示,嗜水氣單胞菌感染后,不同的炎癥相關細胞因子在腸道組織中的表達變化存在差異。IL-10、IL-10Ra、IL-10Rb、IL-2RG、IL-17R、IL-22、IL-23等7個基因在致炎1 d后表達量上調至最高水平;IL-12p40、IL12Rb2基因在第3 d上調至最高。IL-23R、IL-6基因則在致炎后第3 d才顯著上調,而IL-21在致炎后第3 d顯著下調。結論:嗜水氣單胞菌感染引起草魚腸道組織中細胞成分發(fā)生變化,細胞因子活性、氧氣轉運活性、物質跨膜等分子功能失調,細胞有絲分裂、應答細菌感染、免疫應答、ATP的生物合成等生物過程異常,引起腸道炎癥通路相關基因顯著上調,最終導致草魚腸道炎癥的發(fā)生。三、草魚IL-23p19基因的克隆及其在腸道炎癥中的表達特征分析目的:對草魚IL-23p19進行克隆和分子鑒定的基礎上,揭示該基因在腸道炎癥過程中的表達特征及其炎癥發(fā)生中的可能作用。方法:基于轉錄組測序獲得的IL-23p19部分序列設計特異引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技術從草魚腸道組織中克隆IL-23p19的全長c DNA,進而分離其基因組DNA。采用生物信息學分析方法解析該基因的結構、編碼產物、分子演化。構建重組表達質粒p EGFP-C1-gc IL-23p19,轉染HEK293T細胞,揭示草魚IL-23p19蛋白的亞細胞定位。采用實時定量PCR技術,測定IL-23p19在健康草魚組織中的表達譜,分析嗜水氣單胞菌感染對該基因表達的影響,以及不同感染方式下腸道組織內隨時間的表達差異。結果:利用RACE技術成功克隆了草魚IL-23p19基因(gc IL-23p19)的全長c DNA序列,其ORF長567 bp,編碼188個氨基酸。c DNA和基因組DNA序列比對顯示,gc IL-23p19由4個外顯子和3個內含子組成,其外顯子/內含子構成與鯉科魚類斑馬魚和哺乳動物小鼠和人類的同源基因相同�；诎被嵝蛄袠嫿ǖ南到y(tǒng)樹顯示,gc IL-23p19與同屬鯉科的鯉魚、斑馬魚一致性較高而組成一獨立分支,該分支而與其他硬骨魚類聚為一類,而與由鳥類和哺乳動物組成的另一類平行。激光共聚焦分析顯示,IL-23p19蛋白主要定位于HEK293T細胞的細胞質中。實時定量PCR分析結果表明,IL-23p19基因在各種組織中均有表達,但組織間的表達水平存在明顯差異。其中,頭腎、肌肉、肝臟的表達水平最低,而鰓、血液、表皮和體腎的表達最高。腹腔注射嗜水氣單胞菌可顯著上調IL-23p19表達水平,上調幅度最大的組織是腸道,其他依次為表皮、血液、肌肉、脾臟、鰓等。結果還顯示,腹腔注射與肛灌嗜水氣單胞菌兩種不同的感染方式對腸道IL-23p19表達的調節(jié)上存在差異,肛灌24 h后的IL-23p19表達量約達到健康對照的700倍,而腹腔注射僅為70倍。這意味著gc IL-23p19在系統(tǒng)免疫與局部免疫過程中可能存在不同的促炎作用機制。結論:我們首次從養(yǎng)殖魚類中克隆和鑒定了IL-23p19基因,其表達特征表明該基因在嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。四、草魚IL-23R基因克隆及其在腸道炎癥中的功能分析目的:對草魚白細胞介素-23受體基因IL-23R進行克隆和分子鑒定的基礎上,分析該基因在腸道炎癥中的功能。方法:基于轉錄組測序獲得的IL-23R部分序列設計特異引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技術從草魚腸道組織中克隆IL-23R基因的全長c DNA。對該基因進行分子鑒定的基礎上,篩選出IL-23R抗原區(qū)并進行抗原區(qū)基因合成,構建原核表達載體p GEX5T-IL-23R的重組質粒,以原核表達產物為抗原免疫小鼠,制備多克隆抗體rgc IL-23R p Ab,并經Western blot鑒定其特異性。利用嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥模型進行IL-23R的免疫組化分析。采用q PCR技術定量檢測嗜水氣單胞菌刺激前后草魚各組織中IL-23R兩個剪接體的表達水平,分析嗜水氣單胞菌刺激對不同剪接體表達的影響,比較腹腔注射和肛灌嗜水氣單胞菌兩種不同感染方式下IL-23R兩個剪接體在腸道組織中的表達水平。結果:利用RACE技術克隆了草魚IL-23R基因的兩個剪接體gc IL-23RX1與gc IL-23RX2的全長c DNA,大小分別為2875 bp和2730 bp,分別編碼763和717個氨基酸。生物信息學預測顯示,兩種剪接體均含長22氨基酸殘基的信號肽序列,以及一個跨膜結構域。氨基酸序列比對結果顯示,與I型細胞因子受體家族保守的WSXWS基序相比,草魚中相應部位序列為MSEWS,也不同于斑馬魚的CSMWS。系統(tǒng)樹分析顯示,草魚IL-23R基因與斑馬魚基因最為相似,相對地與鳥類、爬行類較為接近,而與哺乳類差異較大。SDS-PAGE分析結果顯示,原核表達的gc IL-23R抗原區(qū)分子量與預測相吻合。Western blot分析證實了多克隆抗體rgc IL-23R p Ab的特異性。腸道免疫組化結果顯示,gc IL-23R在腸上皮細胞以及浸潤于粘膜組織的嗜酸性粒細胞和巨噬細胞中表達,這與哺乳類觀察到的IL-23R表達于T細胞、單核細胞和樹突狀細胞相類似。q PCR分析顯示,IL-23R基因的兩個剪接體在各種草魚組織中均有表達,但總體上gc IL-23RX1的表達水平高于gc IL-23RX2。腹腔注射嗜水氣單胞菌后,各種組織中兩種剪接體的表達水平出現了不同程度的變化。結果還顯示,肛灌對腸道組織gc IL-23RX1和gc IL-23RX2表達的影響明顯大于腹腔注射,而且,gc IL-23RX2的表達水平變化幅度大于gc IL-23RX1。結論:我們首次從養(yǎng)殖魚類中克隆和鑒定了IL-23R基因的兩個轉錄剪接體。IL-23R在嗜水氣單胞菌刺激誘導的草魚腸道粘膜的局部炎癥應答中發(fā)揮了重要的作用。但是,兩種剪接體在草魚腸道炎癥通路中發(fā)揮的功能存在差異。
【關鍵詞】：草魚 腸道炎癥 嗜水氣單胞菌 實驗模型 草魚 嗜水氣單胞菌 轉錄組測序 差異表達基因 腸道炎癥 草魚 IL-23p19 亞細胞定位 表達特征 草魚 IL-23R 剪接體 腸道炎癥
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S943
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-19
• 前言19-25
• 參考文獻21-25
• 第一章 實驗材料與一般方法25-37
• 1 實驗材料25-30
• 1.1 材料25-30
• 2 主要儀器設備30-31
• 3 數據庫及軟件31-32
• 4 常用的實驗方法32-37
• 4.1 主要試驗器具的準備32
• 4.2 總RNA的抽提32
• 4.3 DNA的抽提32-33
• 4.4 瓊脂糖凝膠電泳33
• 4.5 SDS-PAGE蛋白質電泳33
• 4.6 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞的制備與重組DNA的轉化33-34
• 4.7 石蠟切片的取材與制作34-35
• 4.8 電鏡樣品的取材與制作35-36
• 4.9 實時定量PCR (qPCR)36-37
• 第二章 嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥模型的構建37-53
• 引言37
• 1 材料與方法37-41
• 1.1 材料37-38
• 1.2 方法38-41
• 2 結果與分析41-48
• 2.1. 嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥模型41-43
• 2.2 嗜水氣單胞菌誘導的腸道組織變化43-45
• 2.3 腸道上皮細胞表面的超微結構變化45-46
• 2.4 腸道MPO活性變化46-47
• 2.5 嗜水氣單胞菌攻毒處理引起的腸道內促炎細胞因子IL-1b、IL-8 和TNF-a的上調表達47-48
• 3 討論48-50
• 參考文獻50-53
• 第三章 嗜水氣單胞菌誘導草魚腸炎的腸道轉錄組比較研究53-82
• 引言53-54
• 1 材料與方法54-60
• 1.1 材料54
• 1.2 方法54-60
• 2 結果與分析60-76
• 2.1 RNA提取與質量檢測60-61
• 2.2 草魚RNA-seq分析和de novo組裝61-62
• 2.3 預測蛋白質注釋62-63
• 2.4 Unigene功能注釋63-64
• 2.5 GO功能注釋64-65
• 2.6 Unigene代謝通路分析65-67
• 2.7 鑒定和注釋差異表達基因67-68
• 2.8 差異基因的GO分析68-73
• 2.9 差異基因的Pathway分析73-75
• 2.10 差異表達基因的qPCR驗證75-76
• 2.11 腸道炎癥通路中相關基因在嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道中的表達變化..5776
• 3 討論76-78
• 參考文獻78-82
• 第四章 草魚IL-23P19 基因的克隆及其在腸道炎癥中的表達特征分析82-108
• 引言82
• 1 材料和方法82-91
• 1.1 材料82
• 1.2 方法82-91
• 2 結果與分析91-103
• 2.1 IL-23p19 全長cDNA的克隆91-98
• 2.2 gcIL-23p19 基因組序列及其結構98-100
• 2.3 gcIL-23p19 的亞細胞定位100-101
• 2.4 gcIL-23p19 基因的表達譜101
• 2.5 嗜水氣單胞菌感染對草魚組織gcIL-23p19 基因表達的影響101-102
• 2.6 嗜水氣單胞菌不同方式感染后gcIL-23p19 在草魚腸道中的表達差異102-103
• 3 討論103-106
• 參考文獻106-108
• 第五章 草魚IL-23R基因克隆及其在腸道炎癥中的功能分析108-142
• 引言108-109
• 1 材料與方法109-117
• 1.1 材料109
• 1.2 方法109-117
• 2 結果與分析117-137
• 2.1 gcIL-23R基因的克隆及其生物信息學分析117-130
• 2.2 gcIL-23R基因的原核表達與多克隆抗體制備130-132
• 2.3 gcIL-23R基因的表達譜分析132-133
• 2.4 嗜水氣單胞菌誘導對各組織gcIL-23R表達的影響133-134
• 2.5 嗜水氣單胞菌不同感染方式對gcIL-23R在腸道誘導表達的影響134-135
• 2.6 gcIL-23R在嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥模型中的作用135-137
• 3 討論137-139
• 參考文獻139-142
• 第六章 總結與思考142-144
• 1 本研究的結論和意義142-143
• 2 本研究的不足之處143-144
• 文獻綜述144-182
• 1 硬骨魚類腸道粘膜免疫與腸道炎癥的研究進展144-154
• 1.1 硬骨魚類腸道粘膜免疫144-150
• 1.2 魚類的腸道炎癥150-151
• 1.3 炎癥因子在魚類腸道炎癥中的作用151-152
• 1.4 魚類腸炎模型152-154
• 2 IL-23 和IL-23R的研究進展154-163
• 2.1 IL-23 和IL-23R的發(fā)現與分子結構154-156
• 2.2 IL-23 的分泌及作用機理156-157
• 2.3 IL-23R與信號傳導157-159
• 2.4 IL-23 與疾病的關系159-163
• 2.5 IL-23 作為治療炎癥性疾病靶點的應用前景163
• 參考文獻163-182
• 攻讀博士學位期間公開發(fā)表的論文182-183
• 本研究資助項目183-184
• 中英文縮略詞匯表184-186
• 致謝186-187

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前9條

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  本文關鍵詞：嗜水氣單胞菌誘導的草魚腸道炎癥機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：260891