本文關(guān)鍵詞：蓮花瓣類黃酮色素分析及蓮花瓣著色機理研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蓮是蓮科蓮屬的一種古老的多年生水生草本花卉,具有很高的觀賞價值,其中花色是其重要的觀賞元素之一,并決定著蓮的觀賞價值。蓮屬植物有兩個種：蓮(N. nucifera Gaertn)和美洲黃蓮(N. lutea Pers)。其中美洲黃蓮的花只有黃色系,而蓮的花具有紅色、粉紅色、白色和紅/白間色等色系。目前對蓮花色的研究鮮有報道。為了評價不同類黃酮色素對蓮的花色這一性狀的貢獻以及揭示引起蓮紅、白花色差異的機理,本研究首先采用高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-MS)對108種包含紅、粉紅、黃、白和紅/白間色五種花色的蓮種質(zhì)資源品種的花瓣中的類黃酮類色素成分(包括花青素、黃酮和黃酮醇)進行分離和定性、定量分析。然后選取了開紅花的‘野紅蓮’和開白花的‘白鴿’兩種蓮品種的花瓣為材料,進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并結(jié)合兩個品種花瓣中的類黃酮色素積累情況、花青素途徑上結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄水平的分析、候選基因的編碼區(qū)及啟動子區(qū)的序列分析以及其啟動子區(qū)的甲基化水平分析,得出以下結(jié)果：(1)在蓮的種質(zhì)資源品種的花瓣中共檢測到5種花青素,分別為：飛燕草色素3-O-葡萄糖苷(Dp-3-glu)、矢車菊素3-O-葡萄糖苷(Cy-3-glu)矮牽牛色素3-O-葡萄糖苷(Pt-3-glu)、芍藥色素3-O-葡萄糖苷(Pn-3-glu)和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷(Mv-3-glu),以及14種黃酮和黃酮醇,分別為：楊梅黃酮3-O-半乳糖苷(Myr-3-Gal)、楊梅黃酮3-O-葡萄糖苷(Myr-3-Glu)、槲皮素-3-阿拉伯呋喃糖(1→2)-半乳糖吡喃糖苷(Qc-3-Ara-Gal)、楊梅黃酮-3-葡糖糖醛酸酯(Myr-3-Gln)、蘆丁(rutin)、金絲桃苷(hyperoside)、異槲皮苷(isoquercitrin)、槲皮素3-O-葡萄糖苷酸(Qc-3-Gln)、異鼠李素3-O蘆丁糖苷(Iso-3-Rut)、山奈酚3-O-半乳糖苷(Kae-3-Gal)、黃芪苷(astragalin)、異槲皮素3-O-葡萄糖苷(Iso-3-Glu)、山奈酚3-O-葡萄糖苷酸(Kae-3-Gln)和異槲皮素3-O-葡萄糖苷酸(Iso-3-Gln)。而根據(jù)苷元的不同,黃酮和黃酮醇可以分為四大類,分別為楊梅黃酮衍生物(Myr-D)、槲皮素衍生物(Qc-D)、山奈酚衍生物(Kae-D)以及異鼠李素衍生物(Iso-D)。(2)一般情況下,黃色和白色品種的花瓣中幾乎檢測不到花青素,少數(shù)的紅/白間色品種的花瓣中只能檢測到少量的兩到三種花青素。幾乎所有的紅色和粉紅色花瓣中都能檢測到五種花青素,并且紅色花瓣中的含量要比粉紅色的高。在五種花青素中,Mv-3-glu和Dp-3-glu含量較高。除了黃色品種外,其它4種花色的品種中的黃酮和黃酮醇中都是Kae-D的含量最高,而在黃色品種中則是Iso-D的含量最高。(3)選取兩種蓮品種——‘野紅蓮’(紅花)和‘白鴿’(白花)作為代表品種,首先經(jīng)過HPLC-MS分析,在‘野紅蓮’花瓣中鑒定到5種花青素和14種黃酮和黃酮醇,而在‘白鴿’的花瓣中未檢測到任何花青素成分,鑒定到13種黃酮和黃酮醇。原花青素檢測實驗表明‘野紅蓮’和‘白鴿’的花瓣中都含有原花青素(PA)。然后對兩者花瓣的橫切面進行了光學(xué)顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)在‘野紅蓮’花瓣上表皮細胞中有紅色色素的積累,而在‘白鴿’的花瓣中未觀察到色素的積累。(4)對‘野紅蓮’和‘白鴿’的花瓣進行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,共鑒定到88個差異表達蛋白質(zhì),其中36個在‘野紅蓮’中表達量較高,52個在‘野紅蓮’中表達量較低。在所有鑒定到的蛋白質(zhì)中包含4個是參與花青素途徑的酶,分別為：黃烷酮3-羥化酶(F3H)、花青素合酶(ANS)、花青素3-o-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶(UFGT)以及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。其中F3H和UFGT的表達量在‘白鴿’中較高：而ANS和GST在‘野紅蓮’中的表達量較高。(5)對花青素途徑上結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平進行了分析,其中查爾酮合成酶基因(CHS)、黃烷酮3’-羥化酶基因(F3'H)、F3H和UFGT在‘白鴿’中的轉(zhuǎn)錄水平較高；而查爾酮異構(gòu)酶基因(CHI)、黃烷酮3'5'-羥化酶(F3'5'H)、二氫黃酮醇還原酶基因(DFR)、ANS和GST在‘野紅蓮’中的轉(zhuǎn)錄水平較高。F3H和UFGT的轉(zhuǎn)錄水平與其編碼的蛋白質(zhì)的表達水平是一致的,都是‘白鴿’中的表達水平比‘野紅蓮’中的高；ANS和GST這兩個基因的轉(zhuǎn)錄水平與其編碼的蛋白質(zhì)的表達水平也是一致的,都是‘野紅蓮’中的表達水平較高。(6)對ANS基因的開放閱讀框(ORF)及2000 bp左右的啟動子區(qū)序列在‘野紅蓮’和‘白鴿’花瓣中進行了克隆分析,結(jié)果顯示兩個品種之間無序列差異,但是兩者花瓣的ANS基因啟動子區(qū)的甲基化位點和甲基化水平都存在差異。‘白鴿’要比‘野紅蓮’的甲基化位點多出18處(包括14處CG,2處CHH和2處CHG),總體的甲基化水平也比‘野紅蓮’高。由上述結(jié)果,推測出以下結(jié)論：(1)蓮花瓣的紅色是由花青素決定的,且花青素總含量越高,紅色越深。異鼠李素衍生物(Iso-D)可能與蓮花瓣的黃色有一定的相關(guān)性,這也是蓮與美洲黃蓮中類黃酮色素分布的差異。(2) ‘野紅蓮’和‘白鴿’的紅、白花色差異可能是由于紅、白蓮花瓣中的AMS 啟動子區(qū)不同水平的甲基化而影響了其與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,進而影響了ANS 的表達水平以及花青素的積累,從而導(dǎo)致了紅、白蓮花的著色差異。本課題的研究對蓮種質(zhì)資源品種的花瓣中的類黃酮色素進行了評價并對蓮紅、白花瓣的著色機理提出了新的觀點,可能有助于以后蓮新花色的分子育種。
【關(guān)鍵詞】：蓮 色素 高效液相色譜色譜聯(lián)用儀 蛋白質(zhì)組學(xué) 甲基化
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(武漢植物園)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S682.32
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 1 引言13-33
• 1.1 蓮的分類、分布、歷史及用途13-17
• 1.2 蓮的研究現(xiàn)狀17-19
• 1.3 花著色研究及類黃酮代謝途徑的研究現(xiàn)狀19-28
• 1.3.1 決定花色的因素——色素19-20
• 1.3.2 植物中類黃酮類色素的特征20-22
• 1.3.3 植物花朵的著色機理和類黃酮生物合成途徑的研究進展22-27
• 1.3.4 蓮組織中類黃酮物質(zhì)的研究進展27-28
• 1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進展28-30
• 1.5 DNA甲基化的研究進展30-32
• 1.6 本課題的研究目標和意義32-33
• 2. 材料與方法33-49
• 2.1 實驗材料33
• 2.2 化學(xué)試劑及配制33-35
• 2.3 花青素、黃酮和黃酮醇的提取35-36
• 2.4 花青素、黃酮和黃酮醇的高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)分析36
• 2.5 顯微鏡觀察荷花花瓣橫切面36-37
• 2.6 荷花花瓣中原花青素的分析37
• 2.7 蛋白質(zhì)的提取和定量分析37-38
• 2.8 蛋白質(zhì)雙向電泳38-39
• 2.9 蛋白質(zhì)差異表達分析及質(zhì)譜鑒定39-41
• 2.10 蛋白質(zhì)功能分類以及KEGG代謝途徑分析41
• 2.11 RNA的提取和qRT-PCR分析41-43
• 2.12 DNA的提取及兩個蓮品種的ANS基因及其啟動子區(qū)的序列分析43-47
• 2.13 兩個蓮品種花瓣的ANS基因2Kb啟動子區(qū)序列的甲基化水平分析47-48
• 2.14 數(shù)據(jù)分析48-49
• 3 結(jié)果與分析49-73
• 3.1 HPLC-MS分析方法的驗證49
• 3.2 花青素、黃酮和黃酮醇的鑒定49-52
• 3.3 不同荷花品種花瓣中花青素、黃酮和黃酮醇成分和含量的分析52-54
• 3.4 主成分分析54-56
• 3.5 紅、白兩種不同花色的蓮品種花瓣中色素的分析56-61
• 3.6 紅、白兩種不同花色的蓮品種花瓣的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析61-65
• 3.7 荷花花瓣中參與花青素生物合成與積累的差異表達蛋白65-68
• 3.8 ‘野紅蓮’和‘白鴿’花瓣中的ANS基因的啟動子區(qū)的序列分析以及啟動子區(qū)的甲基化水平的分析68-73
• 4 討論73-79
• 4.1 蓮的類黃酮代謝途徑的推斷73-75
• 4.2 紅、白蓮花瓣中的花青素途徑的結(jié)構(gòu)基因的表達分析75-76
• 4.3 蓮花瓣中花青素途徑的調(diào)控機制76-79
• 5 結(jié)論79-81
• 參考文獻81-95
• 附錄A95-99
• 附錄B99-105
• 附錄C105-107
• 附錄D107-109
• 附錄E109-121
• 作者簡介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果121-123
• 致謝123-124

【參考文獻】

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本文編號：260533