本文關(guān)鍵詞：真菌溶磷相關(guān)基因的克隆與功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：我國90%以上耕地缺磷,磷肥的使用是解決作物增產(chǎn)問題的重要措施。但長期以來磷肥的過量使用以及土壤固定化間題造成了嚴重的資源浪費、環(huán)境污染。因此開發(fā)利用溶磷生物肥料,研究溶磷微生物的溶磷機理及溶磷相關(guān)基因,對充分發(fā)揮溶磷微生物在農(nóng)業(yè)中的作用具有重要實踐價值和理論意義。本文從我國北方高化肥施用土壤中篩選了高效溶磷真菌7株。并且重點對其中3株菌株P(guān)4(Penicillium oxalicum)、P93 (Aspergillus aculeatus)以及P85 (Aspergillus niger)的溶磷效果、溶磷條件、分泌有機酸、土壤定植能力、植物促生能力進行研究。數(shù)據(jù)顯示,接種溶磷菌顯著提高溶液中的有效磷濃度,降低溶液pH值。菌株P(guān)93、P4和P85對磷酸鈣的溶解效果最為顯著。溶解磷礦粉最適碳源分別是果糖、葡萄糖和麥芽糖；最適氮源類型分別為尿素、銨態(tài)氮及硝態(tài)氮。溶磷最適溫度都是25-35℃,磷礦粉最適濃度為2 mg/mL。菌株P(guān)93主要產(chǎn)生的蘋果酸和乙酸；P4主要產(chǎn)生的酒石酸和檸檬酸；P85則主要產(chǎn)生的蘋果酸和檸檬酸。盆栽條件下,施用菌劑對不同磷源處理土壤中玉米生物量影響顯著。溶磷菌劑P93、P4和P85分別在以磷酸鈣、磷酸鈣和昆陽磷礦粉為磷源條件下的促生效果最好。溶磷真菌在土壤中定殖能力差異顯著,順序為P93P85P4。施加磷礦粉有利于溶磷菌的定殖。菌劑P93增加土壤有效磷、有機酸濃度最為顯著。添加磷源與種植植物都能增加土壤有機酸濃度。小區(qū)試驗中,菌劑的施加能夠顯著增加玉米產(chǎn)量,最高增產(chǎn)1.22 t/hm2。與對照相比,3種菌劑分別增產(chǎn)15.6%(P93)、15.3%(P4)和12.6%(P85)。根據(jù)以上實驗結(jié)果,選擇菌株P(guān)93為出發(fā)菌,利用PCR-DGGE方法研究菌劑P93的施加對土壤微生物多樣性的影響。結(jié)果表明,接種溶磷菌劑P93能夠顯著增加玉米根際微生物多樣性。本研究構(gòu)建了溶磷真菌P93的λ噬菌體cDNA文庫以及pBluescript SK(+)功能文庫。λ噬菌體文庫滴度為4.9×109 pfu/mL,功能文庫庫容量為6.88×106 cfu/mL,重組率為99.58%。從文庫中篩選到了溶磷相關(guān)基因psf-Yo該序列經(jīng)鑒定為谷氨酸脫氫酶基因且具有一個明顯的開放閱讀框,編碼蛋白含有460個氨基酸殘基,具有兩個主要結(jié)構(gòu)域,分別為Glu/a-酮戊二酸結(jié)合位點基序和NADP輔酶結(jié)合位點基序。液體條件下,攜帶有該基因的克隆子能夠在顯著降低培養(yǎng)基pH值,同時提高有效磷濃度,并且可分泌9種目標有機酸。利用hpRNA表達載體對菌株P(guān)93的psf-Y基因沉默。平板上轉(zhuǎn)化菌的溶磷效果受氮源濃度影響顯著。液體中溶磷能力顯著降低。半定量RT-PCR結(jié)果顯示,野生型菌株psf-Y基因表達量顯著高于轉(zhuǎn)化型菌株。以克隆得到的根特異表達啟動子基因pykl0以及psf-Y基因構(gòu)建了植物表達載體pC-pyk-psf,并且通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化擬南芥。GUS基因表達檢測、PCR以及RT-PCR驗證外源基因已經(jīng)整合到了擬南芥基因組中,并在轉(zhuǎn)錄水平上表達。缺磷培養(yǎng)下,轉(zhuǎn)基因株系根長、莖長及平均鮮重雖高于野生型,但并不顯著。然而全磷濃度顯著高于野生型。正常磷培養(yǎng)下,轉(zhuǎn)基因株系生物量顯著高于野生型,但全磷濃度較野生型無顯著差異。定量RT-PCR檢測psf-Y基因表達量,轉(zhuǎn)基因株系在缺磷條件下的表達量顯著高于正常磷培養(yǎng)條件。
【關(guān)鍵詞】：溶磷真菌 溶磷效果 溶磷相關(guān)基因 基因沉默 轉(zhuǎn)基因擬南芥
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S154.3
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 英文縮略表11-12
• 第一章 引言12-26
• 1.1 我國的磷礦資源12
• 1.1.1 我國的磷礦資源與特點12
• 1.2 土壤中的磷素及其作用12-14
• 1.2.1 土壤中的磷素的形態(tài)12-13
• 1.2.2 磷的作用13-14
• 1.3 磷肥的轉(zhuǎn)化與有效性14
• 1.4 溶磷微生物的研究進展14-17
• 1.5 溶磷微生物溶磷機理的研究17-19
• 1.6 溶磷相關(guān)基因的克隆與功能分析19-21
• 1.7 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的研究進展21-24
• 1.8 研究目的、意義及研究內(nèi)容24-25
• 1.8.1 研究目的和意義24
• 1.8.2 研究內(nèi)容24-25
• 1.9 技術(shù)路線25-26
• 第二章 材料與方法26-47
• 2.1 實驗材料26-31
• 2.1.1 土壤樣品26
• 2.1.2 試驗用土壤與作物種子26
• 2.1.3 磷源26
• 2.1.4 所用菌株、質(zhì)粒和引物26-29
• 2.1.5 培養(yǎng)基29-30
• 2.1.6 試劑及緩沖液30-31
• 2.1.7 主要儀器31
• 2.2 實驗方法31-47
• 2.2.1 溶磷真菌的篩選31
• 2.2.2 溶磷真菌的鑒定31-32
• 2.2.3 溶磷菌液體培養(yǎng)條件下溶磷效果研究32
• 2.2.4 溶磷菌溶磷條件研究32-33
• 2.2.5 液體條件下溶磷菌分泌有機酸測定33
• 2.2.6 液體條件下溶磷菌分泌吲哚乙酸測定33-34
• 2.2.7 溶磷菌溫室盆栽環(huán)境下溶磷、促生效果研究34
• 2.2.8 溶磷菌田間溶磷、促生效果研究34-35
• 2.2.9 溶磷菌土壤定殖能力測定35
• 2.2.10 溶磷菌土壤環(huán)境下分泌有機酸測定35
• 2.2.11 溶磷真菌P93對土壤微生物群落的影響35-37
• 2.2.12 溶磷真菌P93λ噬菌體cDNA文庫的構(gòu)建37-41
• 2.2.13 溶磷相關(guān)基因的篩選與生物信息學分析41
• 2.2.14 真菌體內(nèi)溶磷相關(guān)基因psf-Y功能分析41-43
• 2.2.15 psf-Y基因植物表達載體的構(gòu)建及擬南芥表達43-47
• 第三章 溶磷真菌的分離與篩選47-53
• 3.1 結(jié)果與討論47-52
• 3.1.1 溶磷真菌的篩選47
• 3.1.2 溶磷真菌在平板中的溶磷效果47-49
• 3.1.3 菌株的ITS rRNA基因序列分析49
• 3.1.4 菌株的形態(tài)觀察49-52
• 3.2 結(jié)論52-53
• 第四章 溶磷真菌溶磷效果研究53-63
• 4.1 結(jié)果與討論53-61
• 4.1.1 溶磷菌對難溶磷酸鹽及磷礦粉的測定53-56
• 4.1.2 碳源對溶磷菌溶磷效果的影響56
• 4.1.3 氮源對溶磷菌溶磷效果的影響56-57
• 4.1.4 溫度對溶磷菌溶磷效果的影響57
• 4.1.5 磷礦粉的量對溶磷效果的影響測定57-58
• 4.1.6 高效液相色譜法測定有機酸濃度58-61
• 4.2 結(jié)論61-63
• 第五章 溶磷真菌土壤溶磷、促生效果及生態(tài)效應(yīng)研究63-76
• 5.1 結(jié)果與討論63-74
• 5.1.1 盆栽條件下溶磷菌對玉米生長的影響63
• 5.1.2 盆栽條件下溶磷菌對土壤有效磷的影響63-64
• 5.1.3 盆栽條件下溶磷菌植株全磷的影響64
• 5.1.4 盆栽條件下溶磷菌土壤定殖能力64-66
• 5.1.5 溶磷菌對土壤有機酸濃度的影響66-67
• 5.1.6 小區(qū)試驗中溶磷菌劑對玉米促生和產(chǎn)量的影響67-69
• 5.1.7 小區(qū)試驗中溶磷菌劑對玉米和土壤磷素的影響69-70
• 5.1.8 溶磷菌劑對玉米根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響70-74
• 5.2 小結(jié)74-76
• 第六章 菌株P(guān)93 CDNA文庫構(gòu)建及溶磷相關(guān)基因的篩選76-86
• 6.1 結(jié)果與討論76-85
• 6.1.1 溶磷真菌P93 cDNA文庫的構(gòu)建76-77
• 6.1.2 溶磷相關(guān)基因的篩選和生物信息學分析77-82
• 6.1.3 攜帶基因psf-Y克隆子對溶液pH值以及可溶磷的影響82-83
• 6.1.4 攜帶基因psf-Y克隆子有機酸分泌情況測定83-85
• 6.2 結(jié)論85-86
• 第七章 溶磷相關(guān)基因PSF-Y的功能分析86-100
• 7.1 結(jié)果與討論86-98
• 7.1.1 psf-Y基因沉默質(zhì)粒pSi-psf::hyg的構(gòu)建86-87
• 7.1.2 棘孢曲霉P93原生質(zhì)體的制備87-88
• 7.1.3 PEG轉(zhuǎn)化棘孢曲霉P93原生質(zhì)體88-89
• 7.1.4 野生型菌株與轉(zhuǎn)化菌株形態(tài)學觀察和溶磷能力89-92
• 7.1.5 擬南芥根特異啟動子和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆92
• 7.1.6 表達載體的構(gòu)建92-94
• 7.1.7 pC-pyk-psf轉(zhuǎn)化擬南芥及分子檢測94-95
• 7.1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥種植試驗95-98
• 7.2 結(jié)論98-100
• 第八章 全文結(jié)論100-103
• 參考文獻103-120
• 附錄120-123
• 致謝123-124
• 作者簡歷124

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 崔正忠,尹云鋒,韓芳;利用~(32)P示蹤技術(shù)研究土壤磷素活性劑對大豆吸收土壤和肥料磷素量的影響[J];東北農(nóng)業(yè)大學學報;2001年02期

2 郭敏亮;高佃坤;金英善;;農(nóng)桿菌T-復合物的形成與轉(zhuǎn)運研究進展[J];生物化學與生物物理進展;2009年11期

3 劉錄祥,趙林姝,梁欣欣,鄭企成,劉強,王晶,郭會君,趙世榮,陳文華;基因槍法獲得逆境誘導轉(zhuǎn)錄因子DREB1A轉(zhuǎn)基因小麥的研究[J];中國生物工程雜志;2003年11期

4 郭北海,張艷敏,李洪杰,杜立群,李銀心,張勁松,陳受宜,朱至清;甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因轉(zhuǎn)化小麥及其表達[J];植物學報;2000年03期

5 黃慶海,賴濤,吳強,李茶茍,吳建華,趙美珍;長期施肥對紅壤性水稻土有機磷組分的影響[J];植物營養(yǎng)與肥料學報;2003年01期

6 李志國;崔周全;;我國磷礦資源節(jié)約與綜合利用現(xiàn)狀分析及對策[J];中國礦業(yè);2013年11期

  本文關(guān)鍵詞：真菌溶磷相關(guān)基因的克隆與功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：260392