本文關(guān)鍵詞：層粘連蛋白受體作為豬瘟病毒吸附受體的鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：病毒是結(jié)構(gòu)簡單的微生物,無完整的代謝酶系統(tǒng),需要借助宿主細胞合成自身物質(zhì)從而完成自身生命周期。病毒囊膜蛋白與宿主細胞表面成分——細胞受體的相互結(jié)合則是一切病毒進入宿主細胞的起始,并決定了病毒感染的種屬范圍和組織嗜性。尤為重要的是,病毒囊膜蛋白與相應(yīng)細胞受體的結(jié)合位點往往成為開發(fā)抗病毒藥物的重要靶標(biāo)。因此,針對病毒受體的研究具有重要的科研和應(yīng)用價值。豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的烈性傳染病。該病對養(yǎng)豬業(yè)危害極大,在多個國家均有流行,具有重要的經(jīng)濟意義。近年來,隨著對CSFV研究的不斷深入,研究者發(fā)現(xiàn)了大量與該病毒相互作用的宿主蛋白,并探討了其機理,但針對CSFV細胞受體的研究尚屬空白。迄今,僅有硫酸乙酰肝素(Heparin Sulfate,HS)被鑒定為CSFV的吸附受體。該分子亦廣泛分布于CSFV非易感細胞表面,因此,我們推測CSFV一定存在其它尚未發(fā)現(xiàn)的細胞受體,并采取一系列方法篩選細胞受體。本研究中,我們利用針對大量豬源膜蛋白基因的小分子干擾RNA來篩選可能參與CSFV感染的膜蛋白。該篩選發(fā)現(xiàn)了多個CSFV潛在受體分子。其中,層粘連蛋白受體(Laminin receptor,Lam R)已被鑒定為多種病原體的細胞受體,我們選擇該蛋白進行后續(xù)研究。激光共聚焦分析顯示,該蛋白與CSFV在細胞膜高度共定位。免疫共沉淀試驗說明該蛋白與CSFV囊膜糖蛋白Erns存在特異性相互作用。一系列抑制試驗顯示,抗Lam R蛋白抗體、可溶性Lam R和Laminin蛋白均可顯著抑制CSFV的復(fù)制,并且該抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴性。我們以表達Lam R的慢病毒感染PK-15細胞,構(gòu)建穩(wěn)定表達Lam R的細胞系。CSFV在該細胞系的復(fù)制水平顯著高于對照細胞系。我們利用吸附試驗說明Lam R蛋白在CSFV吸附階段發(fā)揮功能,Lam R過表達細胞系較對照細胞系吸附病毒粒子數(shù)顯著增多。我們進一步探討了HS與Lam R的關(guān)系,結(jié)果顯示,Lam R蛋白和HS互相協(xié)同,幫助病毒吸附。該現(xiàn)象在SK6細胞尤為明顯。但Lam R的表達與CSFV的組織嗜性并無明顯相關(guān)性,而其被沉默后也不影響同屬黃病毒科瘟病毒屬的BVDV的復(fù)制。綜上所述,我們利用si RNA文庫對重要的豬源膜蛋白基因進行篩選,并通過一系列抑制試驗、吸附試驗確定Lam R為CSFV的又一吸附受體,該分子與已知受體HS相互協(xié)同,幫助CSFV感染。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟病毒 細胞受體 層粘連蛋白受體 硫酸乙酰肝素
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.651
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-10
• 英文縮略表10-11
• 第一章 引言11-24
• 1.1 豬瘟與豬瘟病毒11-12
• 1.1.1 豬瘟11
• 1.1.2 豬瘟病毒11-12
• 1.2 豬瘟病毒的復(fù)制和感染機制12-13
• 1.2.1 結(jié)構(gòu)蛋白在CSFV復(fù)制中的功能12
• 1.2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白在CSFV復(fù)制中的功能12-13
• 1.3 病毒的細胞受體研究進展13-19
• 1.3.1 細胞受體13
• 1.3.2 非蛋白類細胞受體的篩選方法13-14
• 1.3.3 蛋白類細胞受體的篩選14-19
• 1.4 豬瘟病毒及黃病毒科病毒細胞受體的研究進展19-22
• 1.4.1 硫酸乙酰肝素19
• 1.4.2 輔膜蛋白CD4619-20
• 1.4.3 低密度脂蛋白受體20-21
• 1.4.4 II型膜聯(lián)蛋白21
• 1.4.5 豬瘟病毒配體的研究21-22
• 1.5 層粘連蛋白受體22-23
• 1.6 本研究的目的與意義23-24
• 第二章 層粘連蛋白受體作為豬瘟病毒吸附受體的鑒定24-54
• 2.1 材料和方法24-33
• 2.1.1 毒株、細胞和載體24
• 2.1.2 其它實驗材料24
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備24-25
• 2.1.4 試劑配制25
• 2.1.5 siRNA分子的設(shè)計25-28
• 2.1.6 干擾分子的轉(zhuǎn)染和指示病毒的感染28
• 2.1.7 Fluc活性檢測28-29
• 2.1.8 病毒毒價的測定29
• 2.1.9 流式細胞術(shù)29
• 2.1.10慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定下調(diào)細胞系和上調(diào)細胞系的構(gòu)建29
• 2.1.11細胞活力檢測29-30
• 2.1.12激光共聚焦試驗30
• 2.1.13細胞膜蛋白的提取30
• 2.1.14免疫共沉淀試驗30
• 2.1.15阻斷試驗30-31
• 2.1.16可溶性蛋白競爭試驗31
• 2.1.17 Western blotting檢測31
• 2.1.18病毒吸附試驗31
• 2.1.19熒光定量RT-PCR31
• 2.1.20受體重建試驗31-32
• 2.1.21適宜CSFV復(fù)制的細胞系的篩選32
• 2.1.22 CSFV感染率的測定32
• 2.1.23 LamR組織豐度檢測32
• 2.1.24 LamR對BVDV復(fù)制影響的檢測32
• 2.1.25數(shù)據(jù)分析32-33
• 2.2 結(jié)果33-50
• 2.2.1 siRNA篩選結(jié)果33
• 2.2.3 LamR沉默效果驗證33-34
• 2.2.4 沉默LamR對不同亞型CSFV復(fù)制的影響34-36
• 2.2.5 CSFV在穩(wěn)定下調(diào)細胞系中的復(fù)制36-38
• 2.2.6 LamR與CSFV共定位情況38
• 2.2.7 LamR與Erns的相互作用38-39
• 2.2.8 可溶性LamR對CSFV復(fù)制的抑制作用39-40
• 2.2.9 可溶性Laminin對CSFV復(fù)制的抑制作用40-41
• 2.2.10 LamR抗體對CSFV復(fù)制的抑制作用41
• 2.2.11 CSFV在穩(wěn)定表達LamR的CSFV易感細胞中的復(fù)制41-43
• 2.2.12 CSFV在穩(wěn)定表達LamR的CSFV非易感細胞中的復(fù)制43-44
• 2.2.13 CSFV在非易感細胞內(nèi)復(fù)制水平檢測44-46
• 2.2.14 CSFV對細胞表面LamR的吸附能力46-47
• 2.2.15 CSFV對肝素酶處理細胞的感染率47-49
• 2.2.16 LamR在豬體不同器官豐度檢測49
• 2.2.17 LamR不影響B(tài)VDV的增殖49-50
• 2.3 討論50-54
• 第三章 全文結(jié)論54-55
• 參考文獻55-65
• 致謝65-66
• 個人簡歷66

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 ;A Novel RT-LAMP Assay for Rapid and Simple Detection of Classical Swine Fever Virus[J];Virologica Sinica;2010年01期

2 ;Development of Multiple ELISAs for the Detection of Antibodies against Classical Swine Fever Virus in Pig Sera[J];Virologica Sinica;2012年01期

3 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 史子學(xué);孫金福;郭煥成;涂長春;;CSFV感染后宿主凋亡相關(guān)基因表達變化的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會暨第六屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

2 史子學(xué);孫金福;郭煥成;涂長春;;CSFV感染后宿主凋亡相關(guān)基因表達變化研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

3 李素;郝建偉;孫金福;郭煥成;郭昌明;孫博興;涂長春;;CSFV感染豬原代血管內(nèi)皮細胞的差異蛋白質(zhì)組分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

4 唐青海;張彥明;郭抗抗;何雷;范麗;仝剛;代晨;;豬瘟病毒(CSFV)NS2蛋白抑制MG132誘導(dǎo)的細胞凋亡作用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第八次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

5 周遠成;王琴;范學(xué)政;徐璐;徐志文;郭萬柱;;豬瘟病毒急性感染對豬外周血淋巴細胞的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會暨第六屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

6 謝金文;沈志強;管宇;韓玲;任艷玲;曲光剛;;CSFV、PRRSV雙重RT-PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2009學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2009年

7 謝金文;沈志強;管宇;韓玲;任艷玲;曲光剛;;CSFV、PRRSV雙重RT-PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2009年

8 杜蘭榮;李云崗;孫圣福;張棟;陳靜;;PRRSV、CSFV和PCV多重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

9 鄭仲華;胡永明;趙明秋;陳金頂;;CSFV強弱毒株RT-PCR快速鑒別檢測方法研究[A];2012年鄂粵微生物學(xué)學(xué)術(shù)年會——湖北省暨武漢微生物學(xué)會成立六十年慶祝大會論文集[C];2012年

10 劉俊;王琴;范學(xué)政;徐璐;湯波;陳蕾;黃偉;;豬瘟病毒急性感染后病毒載量的動態(tài)分布規(guī)律研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會暨第六屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳佳寧;層粘連蛋白受體作為豬瘟病毒吸附受體的鑒定[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 史子學(xué);豬瘟病毒感染豬外周血白細胞轉(zhuǎn)錄組變化的研究[D];吉林大學(xué);2009年

3 李素;豬瘟病毒感染血管內(nèi)皮細胞的差異蛋白質(zhì)及細胞因子表達變化分析[D];吉林大學(xué);2011年

4 何雷;豬瘟病毒NS5A蛋白在病毒致病中作用的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

5 郭抗抗;豬瘟病毒的shRNA干擾、強弱毒鑒別及基因工程疫苗研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

6 李丹;血紅蛋白β亞基對豬瘟病毒增殖的調(diào)控作用及其調(diào)節(jié)機制[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

7 陳鍇;豬瘟慢性感染對豬免疫功能影響的細胞與分子機制研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

8 牛偉;PRRSV和CSFV實時熒光定量PCR方法的建立及PRRSV M蛋白重組質(zhì)粒實驗免疫研究[D];吉林大學(xué);2012年

9 肖一紅;豬瘟DNA疫苗的免疫病理學(xué)和分子病理學(xué)評價[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2007年

10 余興龍;提高豬瘟DNA疫苗免疫保護的探索研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2000年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 何文瑞;細胞硫氧還蛋白2與豬瘟病毒E2蛋白的相互作用及其對豬瘟病毒復(fù)制的調(diào)控作用[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 陳玉燕;9種豬病病原體GeXP多重PCR檢測方法的研究[D];重慶理工大學(xué);2015年

3 周遠成;CSFV SM株感染對豬外周血白細胞的影響以及在豬體內(nèi)的分布[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

4 白雪;不同CSF免疫狀態(tài)下豬體PRRS免疫狀態(tài)及IFN-γ分泌細胞的變化特征的研究[D];吉林大學(xué);2012年

5 陳蕾;豬瘟病毒RT-LAMP快速診斷試劑盒的研制與應(yīng)用[D];中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2009年

6 湯波;豬瘟病毒E2基因RT-PCR檢測方法的建立及病毒分子流行病學(xué)研究[D];西南大學(xué);2009年

7 程浩;豬睪丸細胞多次傳代的CSFV E2基因遺傳變異及E2蛋白在細胞中表達的研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2011年

8 陳恒;穩(wěn)定表達豬干擾素調(diào)節(jié)因子7細胞株的建立及表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)位研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

9 張正興;豬瘟病毒慢性感染對細胞因子轉(zhuǎn)錄的影響[D];中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2012年

10 余樂;Shotgun技術(shù)篩選與豬瘟病毒E2蛋白相互作用的宿主細胞蛋白[D];吉林大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：層粘連蛋白受體作為豬瘟病毒吸附受體的鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：257390