本文關(guān)鍵詞：蘇云金芽胞桿菌Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)及功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1991年首例Cry3Aa蛋白結(jié)構(gòu)成功解析以來,蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的不斷深入,有力地推動了蛋白作用機(jī)制等研究領(lǐng)域的快速發(fā)展,促進(jìn)了蘇云金芽胞桿菌在農(nóng)林業(yè)中更加廣泛的應(yīng)用。為了進(jìn)一步揭示新型殺蟲晶體蛋白的結(jié)構(gòu),探索殺蟲蛋白的作用機(jī)理,擴(kuò)大蘇云金芽胞桿菌的應(yīng)用范圍,緩解與防治田間害蟲中出現(xiàn)的抗性,本研究以我室新克隆表達(dá)的Cry51Aa1蛋白為對象,利用X射線晶體學(xué)衍射技術(shù),較全面而深入地開展了結(jié)構(gòu)及功能的探索。結(jié)果如下:1.解析出與經(jīng)典三結(jié)構(gòu)域型Cry蛋白不同,且對馬鈴薯甲蟲幼蟲有特異性毒性的Cry51Aa1全長蛋白結(jié)構(gòu)。創(chuàng)建了蘇云金芽胞桿菌新穎蛋白結(jié)構(gòu)與殺蟲活性之間的新型關(guān)系,此項(xiàng)研究國內(nèi)尚未見諸報(bào)道。同時(shí),將已解析的蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)的分辨率刷新至1.65?。2.Cry51Aa1蛋白結(jié)構(gòu)主要由β折疊股組成,按結(jié)構(gòu)特性可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域:結(jié)構(gòu)域I位于整個(gè)結(jié)構(gòu)的氨基端,由α螺旋、310螺旋和β折疊股組成;結(jié)構(gòu)域II位于整個(gè)結(jié)構(gòu)的中段,由β發(fā)卡和β片層構(gòu)成;結(jié)構(gòu)域III位于整個(gè)結(jié)構(gòu)的羧基端,含有兩個(gè)β片層。結(jié)構(gòu)域II和結(jié)構(gòu)域III均呈‘β三明治’構(gòu)象。3.Cry51Aa1蛋白三個(gè)結(jié)構(gòu)域具有其自身的特點(diǎn):結(jié)構(gòu)域I富含芳香族氨基酸,可能與受體結(jié)合以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關(guān);結(jié)構(gòu)域II富含色氨酸與蘇氨酸,并含有一個(gè)兩親性β發(fā)卡結(jié)構(gòu)和一段甘氨酸loop,這些模塊可能參與蛋白的多聚和跨膜穿孔過程;結(jié)構(gòu)域III含有完整的羧基尾端,與蛋白酶酶解活化過程緊密聯(lián)系。4.Cry51Aa1在非對稱單元內(nèi)以單體形式存在,但在晶體與溶液中呈晶體學(xué)二聚體狀態(tài)。對結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析表明,Cry51Aa1蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解活化后,二聚體內(nèi)分子間氫鍵被破壞,二聚體裂解形成單體,單體聚集產(chǎn)生六聚體,六聚體可能是蛋白與細(xì)胞膜相互作用時(shí)的多聚形態(tài)。酶解亦會破壞蛋白單體內(nèi)各結(jié)構(gòu)域之間的氫鍵,從而影響兩親性β發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。5.本研究根據(jù)螺旋和β折疊組成及分布特點(diǎn)的相似性,三維結(jié)構(gòu)空間分布相似性、以及典型的兩親性β發(fā)卡結(jié)構(gòu)特征,將Cry51Aa1蛋白歸類于Aerolysin型β穿孔蛋白家族中。同時(shí),比較了Cry51Aa1蛋白單體三結(jié)構(gòu)域與Aerolysin型β穿孔蛋白家族成員結(jié)構(gòu)的異同。6.功能性實(shí)驗(yàn)初步表明,Cry51Aa1蛋白對馬鈴薯甲蟲幼蟲有較高的殺蟲活性。對鞘翅目昆蟲的活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Cry51A類蛋白的殺蟲譜,使之成為結(jié)構(gòu)新穎、且對鞘翅目有特異性殺蟲活性的一類蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體蛋白;對岡比亞按蚊幼蟲細(xì)胞系的毒性測定發(fā)現(xiàn),經(jīng)酶解Cry51Aa1蛋白處理的細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變的現(xiàn)象,說明蛋白能影響細(xì)胞膜的完整性,即活化后的Cry51Aa1蛋白具有溶細(xì)胞活性。本研究利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究手段,摸索并提煉出了一套適用于蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體蛋白表達(dá)體系的蛋白純化、結(jié)晶、X射線衍射、結(jié)構(gòu)解析的完整技術(shù)路線。結(jié)構(gòu)新穎的Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白為蘇云金芽胞桿菌結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究增添了新的成員,也提供了新的研究思路;功能性結(jié)果驗(yàn)證并拓寬了Cry51Aa類蛋白的功能范圍,不僅證實(shí)了Cry51A類蛋白與鞘翅目和半翅目昆蟲細(xì)胞膜之間存在特異的相互作用,也暗示了該類蛋白在昆蟲細(xì)胞膜上的作用方式可能與Aerolsyin型β穿孔蛋白家族類似。對Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)的深入研究和分析,為今后進(jìn)一步闡明Cry51A類蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、作用機(jī)理的研究,以及害蟲生物防治奠定了一定的基礎(chǔ)。本文在闡述Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)及功能研究之前,對目前蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展情況作了一個(gè)較為詳盡的綜述。綜述著力分析、歸納和總結(jié)了蘇云金芽胞桿菌三類不同結(jié)構(gòu)特征晶體蛋白的特點(diǎn);比較分析了相似蛋白結(jié)構(gòu)與相應(yīng)功能的異同;探索了殺蟲晶體蛋白的作用機(jī)制,為Cry51Aa1蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究提供了思路和經(jīng)驗(yàn)。同時(shí),為凸顯現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)的特點(diǎn),本論文對蛋白質(zhì)的X射線晶體學(xué)基本概念與研究方法也進(jìn)行了簡要概述。
【關(guān)鍵詞】：蘇云金芽胞桿菌 殺蟲晶體蛋白 蛋白結(jié)構(gòu)及功能 X射線衍射 殺蟲活性 細(xì)胞毒性
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S476.1
【目錄】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 縮略語表14-16
• 第一章前言16-66
• 1 蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展16-49
• 1.1 蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白的概述16-18
• 1.2 蘇云金芽胞桿菌三結(jié)構(gòu)域型Cry晶體蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究18-33
• 1.2.1 三結(jié)構(gòu)域型Cry晶體蛋白的結(jié)構(gòu)特征與功能21-28
• 1.2.1.1 結(jié)構(gòu)域I的結(jié)構(gòu)特征與功能21-23
• 1.2.1.2 結(jié)構(gòu)域II的結(jié)構(gòu)特征與功能23-25
• 1.2.1.3 結(jié)構(gòu)域III的結(jié)構(gòu)特征與功能25-28
• 1.2.2 Parasporin家族中三結(jié)構(gòu)域型Cry晶體蛋白28
• 1.2.3 三結(jié)構(gòu)域型Cry晶體蛋白與結(jié)構(gòu)類似蛋白的比較與分析28-30
• 1.2.4 三結(jié)構(gòu)域型Cry晶體蛋白作用機(jī)制研究進(jìn)展30-33
• 1.2.4.1 穿孔模型30-32
• 1.2.4.2 信號傳導(dǎo)模型32-33
• 1.3 蘇云金芽胞桿菌Cyt型晶體蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究33-37
• 1.3.1 Cyt型晶體蛋白結(jié)構(gòu)概述33-34
• 1.3.2 Cyt型晶體蛋白與結(jié)構(gòu)類似蛋白的比較與分析34-35
• 1.3.3 Cyt型晶體蛋白作用機(jī)制35-36
• 1.3.4 Cyt與Cry晶體蛋白協(xié)同作用機(jī)制36-37
• 1.4 蘇云金芽胞桿菌Parasporin型晶體蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究37-46
• 1.4.1 Parasporin蛋白的概述與分類37-39
• 1.4.1.1 Parasporin-137-38
• 1.4.1.2 Parasporin-238
• 1.4.1.3 Parasporin-338-39
• 1.4.1.4 Parasporin-439
• 1.4.1.5 其他類Parasporin蛋白39
• 1.4.2 Aerolysin型Parasporin晶體蛋白的結(jié)構(gòu)研究39-41
• 1.4.2.1 結(jié)構(gòu)域I的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能40
• 1.4.2.2 結(jié)構(gòu)域II的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能40-41
• 1.4.2.3 結(jié)構(gòu)域III的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能41
• 1.4.3 Parasporin晶體蛋白與Aerolysin型穿孔蛋白家族的結(jié)構(gòu)比較41-45
• 1.4.3.1 差異最大結(jié)構(gòu)域的比較與分析41-44
• 1.4.3.2 穿孔結(jié)構(gòu)域的比較與分析44-45
• 1.4.4 Aerolysin型穿孔蛋白家族的穿孔作用機(jī)制45-46
• 1.5 小結(jié)46-49
• 2 蛋白質(zhì)的X射線衍射晶體學(xué)概述49-64
• 2.1 生物大分子結(jié)構(gòu)研究方法概述49-50
• 2.2 蛋白質(zhì)的結(jié)晶50-55
• 2.2.1 晶體的幾何學(xué)50-52
• 2.2.2 蛋白質(zhì)的結(jié)晶原理52-53
• 2.2.3 蛋白質(zhì)晶體的實(shí)驗(yàn)室制備53-55
• 2.3 X射線衍射理論概述55-64
• 2.3.1 X射線光源55-58
• 2.3.2 晶體的X射線衍射理論58-61
• 2.3.3 蛋白質(zhì)晶體的結(jié)構(gòu)解析61-64
• 3 Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白的研究目的和意義64-66
• 第二章蘇云金芽胞桿菌Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白的結(jié)構(gòu)研究66-128
• 1 引言66
• 2 材料與方法66-73
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料66-69
• 2.1.1 菌株66-67
• 2.1.2 培養(yǎng)基和抗生素67
• 2.1.3 試劑和儀器67-69
• 2.1.3.1 試劑67-68
• 2.1.3.2 儀器和材料68-69
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法69-73
• 2.2.1 菌株及培養(yǎng)69
• 2.2.2 菌體收集和堿溶處理69-70
• 2.2.3 SDS-PAGE電泳70-71
• 2.2.4 蛋白純化71
• 2.2.5 BCA蛋白濃度測定71
• 2.2.6 蛋白酶酶解反應(yīng)71-72
• 2.2.7 晶體的培養(yǎng)72
• 2.2.8 晶體衍射數(shù)據(jù)收集與結(jié)構(gòu)解析72-73
• 3 結(jié)果與討論73-126
• 3.1 蛋白基本信息的預(yù)測和分析73-77
• 3.1.1 一級結(jié)構(gòu)基本信息分析73-74
• 3.1.2 二級結(jié)構(gòu)分析74-75
• 2.1.3 蛋白序列相似性比對75-76
• 2.1.4 三級結(jié)構(gòu)分析76-77
• 3.2 蛋白表達(dá)與純化結(jié)果分析77-81
• 3.2.1 蛋白培養(yǎng)與表達(dá)77-78
• 3.2.2 蛋白純化78-81
• 3.2.2.1 陰離子交換層析純化79-80
• 3.2.2.2 凝膠過濾層析純化80-81
• 3.3 蛋白濃度的測定與保存81
• 3.4 蛋白酶酶解反應(yīng)結(jié)果81-83
• 3.5 蛋白晶體生長83-95
• 3.5.1 晶體生長條件初篩83-86
• 3.5.2 蛋白純化方法調(diào)整86-87
• 3.5.3 晶體篩選和生長條件再優(yōu)化87-89
• 3.5.4 母體晶體生長條件優(yōu)化和衍射參數(shù)的確定89-91
• 3.5.5 重原子衍生物培養(yǎng)條件優(yōu)化和衍射參數(shù)的確定91-95
• 3.6 晶體衍射數(shù)據(jù)收集95-97
• 3.6.1 母體晶體衍射數(shù)據(jù)收集和分析95-96
• 3.6.2 重原子衍射數(shù)據(jù)收集和分析96-97
• 3.7 相位信息的確定97-99
• 3.7.1 重原子坐標(biāo)的尋找97-98
• 3.7.2 相位求解98-99
• 3.8 結(jié)構(gòu)解析99-100
• 3.8.1 結(jié)構(gòu)初步解析與模型搭建99-100
• 3.8.2 分子置換法解析結(jié)構(gòu)100
• 3.9 結(jié)構(gòu)修正100-102
• 3.10蛋白結(jié)構(gòu)注冊102
• 3.11結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)分析102-104
• 3.12 Cry51Aa1蛋白的單體結(jié)構(gòu)特征104-112
• 3.12.1 結(jié)構(gòu)域I106-108
• 3.12.2 結(jié)構(gòu)域II108-109
• 3.12.3 結(jié)構(gòu)域III109-110
• 3.12.4 單體內(nèi)部相互作用力110-112
• 3.13 Cry51Aa1蛋白的二聚體結(jié)構(gòu)特征112-116
• 3.13.1 二聚體結(jié)構(gòu)與二聚體內(nèi)相互作用力112-114
• 3.13.2 二聚體間相互作用力114-115
• 3.13.3 與Aerolysin型穿孔蛋白在晶體/溶液中聚集狀態(tài)比較115-116
• 3.14分析超速離心法測定蛋白聚集狀態(tài)116-117
• 3.15羧基端酶解導(dǎo)致Cry51Aa1蛋白由二聚體裂解為單體117-119
• 3.15.1 酶解反應(yīng)發(fā)生在羧基末端117-118
• 3.15.2 羧基端酶解破壞分子間相互作用力118-119
• 3.16結(jié)構(gòu)域I芳香族氨基酸的作用119-121
• 3.17絲氨酸/蘇氨酸的作用121-124
• 3.18甘氨酸Loop124-125
• 3.19兩親性發(fā)卡結(jié)構(gòu)125-126
• 4 本章小結(jié)126-128
• 第三章 蘇云金芽胞桿菌Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白的功能研究128-138
• 1 引言128
• 2 材料與方法128-132
• 2.1 Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白對馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）幼蟲殺蟲活性研究128-130
• 2.1.1 蛋白樣品的制備128-129
• 2.1.2 馬鈴薯甲蟲幼蟲的飼養(yǎng)129
• 2.1.2.1 馬鈴薯植株的培育129
• 2.1.2.2 馬鈴薯甲蟲幼蟲的飼養(yǎng)129
• 2.1.3 對馬鈴薯甲蟲幼蟲殺蟲活性的生物測定方法129-130
• 2.2 Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白對岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）Ag55細(xì)胞系的毒性研究130-132
• 2.2.1 蛋白樣品的制備130
• 2.2.2 岡比亞按蚊Ag55細(xì)胞系的培養(yǎng)130-131
• 2.2.2.1 Ag55細(xì)胞系130
• 2.2.2.2 培養(yǎng)基與主要實(shí)驗(yàn)器材130-131
• 2.2.2.3 細(xì)胞系的培養(yǎng)131
• 2.2.3 對岡比亞按蚊Ag55細(xì)胞系毒性的測定方法131-132
• 3 結(jié)果與討論132-136
• 3.1 Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白對馬鈴薯甲蟲幼蟲的殺蟲活性132-133
• 3.2 Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白與Cry51Aa2蛋白比較分析133-134
• 3.3 Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白對岡比亞按蚊Ag55細(xì)胞系的溶細(xì)胞毒性134-136
• 4 小結(jié)136-138
• 第四章總結(jié)與展望138-141
• 參考文獻(xiàn)141-158
• 已發(fā)表的論文158
• 蛋白結(jié)構(gòu)注冊158-159
• 致謝159-160

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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3 郭文超;鄧春生;李國清;鄧建宇;姜衛(wèi)華;吳家和;王佩玲;譚萬忠;張青文;;我國馬鈴薯甲蟲生物防治技術(shù)研究進(jìn)展[J];新疆農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年12期

  本文關(guān)鍵詞：蘇云金芽胞桿菌Cry51Aa1殺蟲晶體蛋白結(jié)構(gòu)及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：257326