發(fā)布時間：2017-03-20 04:09

  本文關(guān)鍵詞：半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）免疫相關(guān)基因HMGB2和IFIT1功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究從半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)中克隆了兩個免疫相關(guān)基因HMGB2(high-mobility group protein B2)和IFIT1(i nterferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1),命名為CsHMGB2和CsIFIT1,并研究了它們的表達模式以及在宿主抵抗病原感染過程中的作用。在哺乳動物中,高速泳動族蛋白(HMG)已知有多種不同的功能,而在魚類中HMG相關(guān)的研究較少。本研究中,我們從半滑舌鰨cDNA文庫中克隆到了HMGB家族的一個基因,CsHMGB2,并研究其生物學(xué)功能。CsHMGB2蛋白共有245個氨基酸殘基,兩個HMG結(jié)構(gòu)域和一個由23個天冬氨酸/谷氨酸殘基組成的酸性羧基尾部。熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)實驗結(jié)果表明CsHMGB2在多個組織表達,并且其表達在病毒或細菌后顯著上調(diào)。體外細胞實驗發(fā)現(xiàn),重組蛋白rCsHMGB2和缺失了C端酸性氨基酸區(qū)域的突變型重組蛋白rCsHMGB2M都能顯著提高半滑舌鰨外周血淋巴細胞(PBL)抵抗細菌侵染的能力。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)rCsHMGB2顯著增強PBL中多種細胞因子和趨化因子的表達。體內(nèi)實驗表明,rCsHMGB2顯著抑制病原在半滑舌鰨脾臟和腎臟中的侵染。上述實驗結(jié)果表明,CsHMGB2具有免疫調(diào)節(jié)功能和抗病原感染作用,并且這種能力與其酸性羧基端無關(guān)。干擾素誘導(dǎo)基因IFIT在哺乳動物免疫系統(tǒng)中具有抗病毒功能,而在魚類中的功能仍然未知。在本研究中,我們從半滑舌鰨cDNA文庫中克隆到了IFIT家族的一個基因,CsIFIT1,并研究了它的抗病毒感染的活性。CsIFIT1由436個氨基酸殘基組成,與其它魚類IFIT蛋白的序列相似度介于30.9%和58.7%之間。軟件分析鑒定出兩個TPR(tetratricopeptide repeats)結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR實驗表明,Cs IFIT1的表達在免疫相關(guān)的器官組織中最高,并且在魚體感染腫大細胞病毒后明顯上調(diào)。在半滑舌鰨中過量表達CsIFIT1可以顯著抑制腫大細胞病毒在魚體中的復(fù)制。同樣,使用RNA干擾技術(shù)降低CsIFIT1表達后,病毒在組織中的復(fù)制量顯著增高。這些結(jié)果表明,Cs IFIT1在魚類抗病毒免疫中起關(guān)鍵作用。
【關(guān)鍵詞】：半滑舌鰨 high-mobility group protein interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 抗細菌感染 抗病毒感染
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S943
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 緒論11-21
• 1.1 魚類病害及先天免疫相關(guān)基因11-16
• 1.1.1 凝集素11-12
• 1.1.2 溶菌酶12
• 1.1.3 抗菌肽12-13
• 1.1.4 補體分子13
• 1.1.5 Toll樣受體13-14
• 1.1.6 干擾素14
• 1.1.7 趨化因子14-16
• 1.2 半滑舌鰨HMGB2基因和IFIT1基因16-19
• 1.2.1 HMGB2基因16-18
• 1.2.2 IFIT1基因18-19
• 1.3 研究目的及意義19-21
• 第二章 半滑舌鰨穩(wěn)定內(nèi)參篩選21-35
• 2.1 材料和方法21-26
• 2.1.1 實驗用魚21
• 2.1.2 實驗用菌株21
• 2.1.3 病原侵染和組織收集21-22
• 2.1.4 mRNA提取及cDNA合成22-23
• 2.1.5 熒光定量PCR引物設(shè)計23-25
• 2.1.6 PCR擴增效率25
• 2.1.7 qRT-PCR25
• 2.1.8 數(shù)據(jù)分析25-26
• 2.2 結(jié)果和討論26-35
• 2.2.1 PCR引物擴增效率26
• 2.2.2 正常生理條件下候選內(nèi)參基因的表達26-27
• 2.2.3 E．tarda感染對候選內(nèi)參基因表達的影響27-29
• 2.2.4 病毒感染對候選內(nèi)參基因表達的影響29-32
• 2.2.5 討論32-35
• 第三章 半滑舌鰨HMGB2功能研究35-57
• 3.1 材料和方法35-43
• 3.1.1 實驗用菌株及受態(tài)菌制備35
• 3.1.2 CsHMGB2序列克隆35-36
• 3.1.3 序列分析36
• 3.1.4 CsHMGB2在正常組織中的表達36-37
• 3.1.5 CsHMGB2在魚體感染病原后的差異表達37
• 3.1.6 CsHMGB2表達載體構(gòu)建37-38
• 3.1.7 CsHMGB2活性重組蛋白表達及純化38-40
• 3.1.8 半滑舌鰨外周血淋巴細胞的提取40-41
• 3.1.9 細菌刺激PBL后Cs HMGB2的差異表達41
• 3.1.10 重組蛋白rCsHMGB2對PBL免疫相關(guān)基因表達影響41
• 3.1.11 重組蛋白rCsHMGB2和rCsHMGB2M對PBL抗細菌感染能力的影響41-42
• 3.1.12 rCsHMGB2和rCsHMGB2M對魚體影響42-43
• 3.2 結(jié)果和討論43-57
• 3.2.1 CsHMGB2序列分析43-46
• 3.2.2 CsHMGB2正常組織中的表達差異46-47
• 3.2.3 CsHMGB2在魚體感染病原后的差異表達47-48
• 3.2.4 CsHMGB2活性蛋白表達及純化48-49
• 3.2.5 細菌感染對CsHMGB2在PBL中表達的影響49-50
• 3.2.6 重組蛋白rCs HMGB2對PBL免疫相關(guān)基因表達影響50-51
• 3.2.7 重組蛋白rCs HMGB2和rCsHMGB2M對PBL抗細菌感染能力的影響51-52
• 3.2.8 rCsHMGB2和rCsHMGB2M對魚體影響52-54
• 3.2.9 討論54-57
• 第四章 半滑舌鰨IFIT1功能研究57-74
• 4.1 材料和方法57-62
• 4.1.1 CsIFIT1序列克隆57
• 4.1.2 序列分析57
• 4.1.3 CsIFIT1在正常組織中的表達差異57-58
• 4.1.4 CsIFIT1在魚體感染病毒后的表達變化58
• 4.1.5 CsIFIT1過量表達質(zhì)粒構(gòu)建58-59
• 4.1.6 無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取59
• 4.1.7 CsIFIT1在魚體過量表達實驗59-60
• 4.1.8 過量表達CsIFIT1對半滑舌鰨抗病毒侵染能力的影響60-61
• 4.1.9 魚體水平RNA干擾Cs IFIT1實驗61
• 4.1.10 RNA干擾CsIFIT1對半滑舌鰨抗病毒侵染能力的影響61-62
• 4.2 結(jié)果和討論62-74
• 4.2.1 CsIFIT1序列分析62-64
• 4.2.2 CsIFIT1正常組織中的表達差異64-65
• 4.2.3 CsIFIT1在魚體感染病毒后的表達變化65-66
• 4.2.4 過量表達CsIFIT1后組織中質(zhì)粒DNA及質(zhì)粒來源mRNA的檢測66-67
• 4.2.5 過量表達CsIFIT1后對半滑舌鰨抵抗病毒侵染能力的影響67-68
• 4.2.6 RNA干擾效率檢測68-69
• 4.2.7 RNA干擾CsIFIT1對半滑舌鰨抗病毒侵染能力的影響69-71
• 4.2.8 討論71-74
• 結(jié)論74-76
• 參考文獻76-90
• 附錄90-95
• 發(fā)表論文與研究成果95

【共引文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）免疫相關(guān)基因HMGB2和IFIT1功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：257131