【摘要】：黃瓜作為世界蔬菜生產(chǎn)的重要栽培作物,因其味道清香、口感爽脆,深受人們喜愛,在市場消費中占有重要地位。然而黃瓜在生產(chǎn)過程中經(jīng)常受到多種病害和蟲害的危害,嚴重影響產(chǎn)量或者品質(zhì),其中黃瓜霜霉病的影響最為嚴重。霜霉威(propamocarb,PM)是一種可以有效控制黃瓜霜霉病的殺菌劑,主要以噴施方式進行防治,病害得到防治的同時,也會使霜霉威在黃瓜體內(nèi)產(chǎn)生殘留。近年來,隨著生活質(zhì)量的提高,人們越來越重視食品安全問題,尤其是農(nóng)藥殘留。因此,黃瓜低農(nóng)藥殘留性的研究,不僅可以有效減少農(nóng)藥使用量,降低生產(chǎn)成本,減少對環(huán)境的污染,還能更好地防止對人體健康的危害。ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因在植物解毒代謝中起著重要的作用,參與多種抗逆反應(yīng)。本研究選取黃瓜低殘留品系D0351和高殘留品系D9320為研究對象,克隆了2個ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因,并在生物信息學(xué)分析、表達模式分析、遺傳轉(zhuǎn)化驗證等方面展開了研究,主要結(jié)果如下:(1)基于低霜霉威殘留品系D0351霜霉威脅迫處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),得到29個差異表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因,進化分析表明這些ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因分別屬于5個ABC亞家族的成員,包括ABCB 6個、ABCC 7個、ABCG 10個、ABCF 2個、ABCI 4個。(2)利用q RT-PCR技術(shù)分析了黃瓜CsABC19、Cs PDR和Cs MRP基因經(jīng)霜霉威脅迫后的表達情況,發(fā)現(xiàn)在低殘留品系D0351和高殘留品系D9320中,受霜霉威脅迫Cs ABC19轉(zhuǎn)錄水平分別呈現(xiàn)誘導(dǎo)上調(diào)和下調(diào),CsPDR轉(zhuǎn)錄水平均呈誘導(dǎo)上調(diào),而CsMRP轉(zhuǎn)錄水平均呈誘導(dǎo)下調(diào)。霜霉威處理下不同時期不同組織表達分析表明,黃瓜Cs ABC19和Cs PDR基因在低殘留品系D0351中被誘導(dǎo)表達增加的倍數(shù)要高于高殘留品系D9320,并且其能快速響應(yīng)霜霉威信號,能夠在霜霉威脅迫初期發(fā)揮重要作用。(3)不同組織的表達分析結(jié)果顯示黃瓜Cs ABC19和Cs PDR基因呈組成性表達,且具有組織差異性和品種差異性,D0351的生殖器官中(果皮、果肉、雌花和雄花)表達量高于D9320,相反,營養(yǎng)器官中(葉片、莖和根)表達量低于D9320。(4)克隆了黃瓜CsABC19和CsPDR基因,分別屬于ABCF亞家族和ABCG亞家族,多序列比對結(jié)果表明,Cs ABC19與其他植物ABC蛋白的氨基酸序列在Walker A、Walker B以及ABC標簽基序處高度保守;CsPDR基因編碼的蛋白具有全轉(zhuǎn)運子結(jié)構(gòu),包含2個跨膜結(jié)構(gòu)域(trans-membrane domains)和2個核苷酸結(jié)合區(qū)域(nucleotide binding domains);啟動子序列預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),存在調(diào)控真核基因轉(zhuǎn)錄的基本元件和一些與激素及脅迫誘導(dǎo)等相關(guān)的調(diào)控元件。同時構(gòu)建了Cs ABC19和CsPDR基因過表達載體。(5)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的Cs ABC19基因植物過量表達載體導(dǎo)入擬南芥,獲得轉(zhuǎn)基因純合株系,進一步對轉(zhuǎn)基因及野生型進行霜霉威和糖脅迫處理,結(jié)果表明,Cs ABC19基因提高了轉(zhuǎn)基因植株對霜霉威和糖脅迫的適應(yīng)性和耐性,并且使轉(zhuǎn)基因植株的霜霉威殘留量有所降低。(6)成功構(gòu)建Cs ABC19基因與綠色熒光蛋白(GFP)的融合表達載體,通過綠色熒光蛋白(GFP)瞬時表達系統(tǒng)分析檢測,CsABC19基因在細胞核、細胞膜及細胞質(zhì)中表達。(7)研究了黃瓜649和D9320品種對Kan的敏感性。黃瓜649和D9320的Kan不定芽誘導(dǎo)選擇壓濃度分別為75mg/L和50mg/L,根誘導(dǎo)選擇壓濃度均為50mg/L。最佳侵染時間為20min,最佳共培養(yǎng)時間為3d。(8)獲得轉(zhuǎn)Cs ABC19基因黃瓜株系5株,檢測為陽性植株。
【圖文】：

圖 1-1 不同生物體的 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白Fig. 1-1ABC transporter proteins in allorganisms1.1.4.1 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)及作用機理ABC 轉(zhuǎn)運蛋白一般都存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域（transmembrane domain，TMD）和核苷酸結(jié)合區(qū)域（nucleotide binding domain，NBD），其中每個 NBD 含有 3 個高度保守的特征基序（WalkeA 盒［GXXGXGKS/T］ ［(RK) X3GX3L (hydrophobic)3］和 Walker C）ǎNBD 能夠結(jié)合并水解 ATP，而 TMD 進一步利用水解 ATP 產(chǎn)生的能量，選擇底物完成跨膜轉(zhuǎn)運ǎABC 轉(zhuǎn)運蛋白可以在不同生物體內(nèi)找到，并且它們的結(jié)構(gòu)相似程度大，NBD 保守性高，也就使得它們的作用機制也具有一定的相似性ǎ目前，ABC 轉(zhuǎn)運蛋白作用機理可以用一種門控模式的說法加以解釋說明，此種說法也能夠被人們接受ǎ當 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白具有膜外結(jié)合蛋白時，TMD 形成運輸通道，，底物被轉(zhuǎn)運之前，外周質(zhì)的門呈現(xiàn)開放狀態(tài)，向胞質(zhì)面的門呈現(xiàn)關(guān)閉狀態(tài)ǎ當膜外結(jié)合蛋白與底物結(jié)合時，信號傳遞到 NBD，使 NBD 發(fā)生結(jié)合同時水解產(chǎn)生 ATP，引起 TMD構(gòu)象變化，使底物分子完成跨膜轉(zhuǎn)運[41-44]ǎ1.1.4.2 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的進化在擬南芥中，ABC 轉(zhuǎn)運蛋白包含 13 個亞家族，并且其結(jié)構(gòu)域組織形式多樣化，其中全分子的 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白包含 4 個典型的結(jié)構(gòu)域，以正向方式（TMD-NBD-TMD-NBD）連接的

圖 1-2 擬南芥 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白概述Fig. 1-2 Overview of the ArabidopsisABC transporters1.1.5 基因功能分析方法隨著生命科學(xué)的發(fā)展及研究領(lǐng)域的不斷開拓，生物和生命科學(xué)的研究已轉(zhuǎn)向分子水平，并且研究內(nèi)容也不斷深入和推進，進而獲得的未知新基因也越來越多，對基因新功能的研究開展地越來越迅速，新基因的成功克隆也為基因功能研究提供了重要條件，因此對新基因功能的研究顯得日益重要，這也是后基因組時代功能基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容和首要任務(wù)[77]ǎ1.1.5.1 促使基因表達基因功能研究的功能獲得可以通過將新基因直接導(dǎo)入到某一細胞或個體中，促使基因的表達，通過對細胞的生物學(xué)行為變化加以觀察，或個體表型遺傳性狀發(fā)生的改變來判定和確定基因的功能，可以利用基因瞬時表達 過量表達和異源表達等方法�；蜻^量表達（Gene overexpression），首先將獲得的目的基因全長序列與高活性的組成型或組織特異性啟動子融合，然后利用轉(zhuǎn)化方法，使該基因整合到植物或動物基因組中，進而獲得基因產(chǎn)物大量積累的個體ǎ基因超表達技術(shù)能夠控制外源基因在時間 空間或特定組織中的表達，可以對基因功能進行系統(tǒng)性的研究ǎSu 等[78]的研究表明，AGL15 超表達可以
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.421.11

【參考文獻】

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本文編號：2572024