【摘要】：化石能源的劇烈消耗使得能源問題越來越嚴(yán)峻,來源豐富、價(jià)格低廉并且對(duì)環(huán)境友好的生物能源正逐漸成為研究熱點(diǎn)。但是由于木質(zhì)素自身的抗降解特性,對(duì)木質(zhì)纖維素的利用同時(shí)存在著諸多的經(jīng)濟(jì)上和技術(shù)上的障礙。預(yù)處理木質(zhì)纖維素能夠增加水解酶對(duì)葡聚糖和木聚糖的接觸性。相對(duì)于傳統(tǒng)的理化預(yù)處理,生物預(yù)處理由于使用的真菌及其分泌的酶來源天然、環(huán)境友好并且作用條件溫和而具有多種優(yōu)勢(shì),但是生物預(yù)處理效率偏低,需要篩選高效降解木質(zhì)素的擔(dān)子菌,同時(shí)需要對(duì)木質(zhì)素生物合成途徑進(jìn)行遺傳操作來改變木質(zhì)素的含量和單體比例,最終提高預(yù)處理的效率并最終達(dá)到提高乙醇產(chǎn)量的目的。此外,在降低植物木質(zhì)素的含量的同時(shí)結(jié)合高效降解木質(zhì)素的酶學(xué)處理在制漿、漂白和廢水處理等行業(yè)也有巨大的應(yīng)用前景。白靈菇能夠大量高效地分泌胞外漆酶,本研究連續(xù)使用DEAE-cellulose、 CM-cellulose和 Q-Sepharose離子交換層析和Superdex 75分子排阻層析,得到Lac1、Lac2和Lac3三個(gè)漆酶同工酶,分子量分別為68、64和51 kDa。三者的最適pH均為3.0,Lac1和Lac3的最適溫度位于50-60℃之間,Lac2的最適溫度為60℃。Lac2在30-70℃處理區(qū)間內(nèi)具有最佳的溫度穩(wěn)定性,Lac2在pH 3.0-8.0的范圍內(nèi)不如其他兩種同工酶穩(wěn)定,但是不同pH對(duì)Lac2活性的抑制主要發(fā)生在處理的起始階段。Lac1、Lac2和Lac3對(duì)芳香性底物的作用特性各不相同,每種同工酶都能選擇性地高效氧化某些底物。動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Km和Kcat)顯示,Lac3對(duì)ABTS有最高的親和力,但是Lac2對(duì)ABTS的催化效率最高。Gel-Fractionation LC-LTQ-Orbitrap-MS得到的同工酶肽段與數(shù)據(jù)庫中的漆酶家族成員具有高相似性。選取含量最高、性質(zhì)穩(wěn)定且能夠氧化多種結(jié)構(gòu)的底物的Lac2對(duì)染料進(jìn)行脫色,相對(duì)于水提物,Lac2催化效率更高,但是通過延長(zhǎng)脫色時(shí)間,水提物也能達(dá)到與Lac2相當(dāng)?shù)拿撋潭取＿M(jìn)一步分析Lac2對(duì)孔雀綠的解毒作用表明,降解產(chǎn)物對(duì)六種供試的細(xì)菌和真菌都無毒性,GC-MS分析證明孔雀綠分子的降解首先經(jīng)歷四個(gè)甲基基團(tuán)的移除,形成的氨基基團(tuán)進(jìn)一步被降解或發(fā)生聚合反應(yīng),最終形成無毒無色的物質(zhì)。Arogenate dehydratase (ADT)是催化苯丙氨酸生物合成最后一步的關(guān)鍵蛋白,除合成蛋白質(zhì),苯丙氨酸也是合成許多次生代謝產(chǎn)物的前體。使用RNAi技術(shù),分別降低PtaADT1、PtaADT2、 PtaADT3并同時(shí)降低PtaADT1和PtaADT2在雜交楊樹中的表達(dá)量,結(jié)果表明PtaADT1-RNAi、 PtaADT3-RNAi和 PtaADT1-RNAi::PtaADT2-RNAi能夠降低木質(zhì)素的含量。UPLC-ESI-MS結(jié)合基于R算法的XCMS進(jìn)行無目的的代謝產(chǎn)物處理分析表明,PtaADT-RNAi對(duì)葉片組織中的代謝產(chǎn)物積累都有顯著性影響；除PtaADT3-RNAi 之外, PtaADT-RNAi對(duì)枝干中次生代謝產(chǎn)物同樣產(chǎn)生顯著性的影響。水楊酸鹽、羥基肉桂酸衍生物和黃酮類等與苯丙烷代謝相關(guān)的物質(zhì)在轉(zhuǎn)基因葉片中的積累量較野生型較低,但是在枝干中,這些小分子的含量卻比野生型要高。此外,一些非苯丙烷類物質(zhì)如萜類含量也受到PtaADT-RNAi的影響。分別測(cè)量堿水解葉片和枝干提取物后釋放的常見酚酸含量,酚酸的積累情況與次生代謝產(chǎn)物的積累情況類似,從而進(jìn)一步驗(yàn)證了代謝物的變化趨勢(shì)。綜上,本研究成功分離得到了三個(gè)具有高降解活性的漆酶,并首次在木質(zhì)植物中驗(yàn)證ADT對(duì)木質(zhì)素和次生代謝產(chǎn)物的合成具有重大的作用。利用白靈菇漆酶來作用低木質(zhì)素含量的雜交楊樹對(duì)生物能源的開發(fā)具有重要意義,同時(shí)結(jié)合使用本研究中具高降解活性的白靈菇漆酶和低木質(zhì)素含量的楊樹材料對(duì)制漿行業(yè)的高效脫漿也有深遠(yuǎn)意義。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S792.11
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本文編號(hào)：2571793