發(fā)布時(shí)間：2020-01-21 00:37

【摘要】：抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)作為廣譜抗菌、抗病毒且不易引起耐藥的小分子多肽藥物受到廣泛重視,在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、材料等領(lǐng)域開展了大量應(yīng)用研究�，F(xiàn)階段我國養(yǎng)豬業(yè)面臨著耐藥菌株不斷出現(xiàn)、病毒病流行等困擾,研究可抑制病原復(fù)制的新型制劑,具有重要現(xiàn)實(shí)意義。因此本研究選取α螺旋抗菌肽cecropin B,moricin,piscidin,caerin,maculatin和其它結(jié)構(gòu)的lactoferricin B,indolicidin作為代表,研究其對(duì)豬場(chǎng)常見病原的抑制活性及作用機(jī)制。進(jìn)而以HNP4作為代表性多肽,研究其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系,為進(jìn)一步解析其作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.cecropin B和moricin對(duì)豬場(chǎng)常見病原菌的抗菌活性及作用機(jī)制研究篩選具有抗菌效果的抗菌肽:通過對(duì)副豬嗜血桿菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬鏈球菌等八種豬場(chǎng)常見細(xì)菌的抗菌活性研究,發(fā)現(xiàn)moricin對(duì)所有病原菌均具有抑制作用,而cecropin B對(duì)革蘭氏陰性菌有更強(qiáng)烈抑制作用。通過殺菌曲線發(fā)現(xiàn)二者能夠在短時(shí)間內(nèi)殺滅所有細(xì)菌。細(xì)菌疏水性、電荷性與對(duì)cecropin B敏感性之間的關(guān)系:測(cè)試了cecropin B對(duì)副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及部分臨床菌株的抑制作用,發(fā)現(xiàn)均具有較好的活性(MIC為2μg/ml-16μg/ml)。通過十六烷吸附試驗(yàn)和電泳試驗(yàn)研究了不同菌株膜表面的疏水性和電荷性,與其對(duì)cecropin B的敏感性之間建立關(guān)系,發(fā)現(xiàn)疏水性越強(qiáng)和帶負(fù)電荷越多的菌株對(duì)cecropin B越敏感。抗菌肽cecropin B引起副豬嗜血桿菌形態(tài)學(xué)變化的觀察:利用透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)和原子力顯微鏡(AFM)等手段觀察細(xì)菌形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)cecropin B能夠損壞細(xì)菌膜導(dǎo)致質(zhì)膜分離、內(nèi)容物外泄和中空細(xì)胞等現(xiàn)象。同時(shí)可以觀察到致密電子點(diǎn)形成等細(xì)菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變。表明抗菌肽能作用于細(xì)菌膜結(jié)構(gòu),同時(shí)也有可能作用于細(xì)菌內(nèi)靶位點(diǎn)。研究結(jié)果表明cecropin B可作為候選的抗革蘭氏陰性菌藥物開發(fā)。2.抗菌肽對(duì)豬源病毒的抑制活性和作用機(jī)制研究抗病毒多肽的篩選:由于moricin和cecropin B對(duì)病毒抑制作用不明顯,根據(jù)報(bào)道重新選取了五種不同來源的抗菌肽piscidin,maculatin,caerin,lactoferricin B,indolicidin對(duì)偽狂犬病毒(PRV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和輪狀病毒(RV)進(jìn)行抗病毒活性研究。TCID50測(cè)定piscidin,maculatin,caerin對(duì)大部分病毒抑制作用較強(qiáng),抗病毒活性與其濃度呈正比。piscidin和caerin處理PRV后的病毒存活率僅為2%,作用最強(qiáng),并可抑制不同偽狂犬病毒毒株�？咕膶�(duì)PRV復(fù)制過程的抑制研究:通過病毒感染前多肽處理細(xì)胞、病毒感染后多肽處理細(xì)胞以及多肽直接處理病毒粒子三種方式,研究抗菌肽對(duì)病毒復(fù)制階段的影響。發(fā)現(xiàn)maculatin,caerin和piscidin均直接作用于病毒粒子。通過非線性回歸分析計(jì)算IC50,表明多肽對(duì)PRV的抑制活性從高到低為piscidinmaculatincaerin。細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗菌肽能夠顯著抑制病毒引起的細(xì)胞凋亡。用小鼠作為模型,測(cè)定piscidin抗PRV感染的能力:通過小鼠試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)piscidin在低至2.5μg/ml濃度時(shí)仍能殺滅PRV,對(duì)小鼠提供90%的保護(hù),并且在大于5μg/ml濃度時(shí)就能夠完全保護(hù)小鼠免受PRV致死性感染。這表明piscidin可以作為抗病毒藥物進(jìn)行開發(fā)。3.HNP4的結(jié)構(gòu)-功能活性研究氨基酸和結(jié)構(gòu)改變對(duì)HNP4抑菌活性的影響:首先合成、純化出高質(zhì)量HNP4及突變體,通過抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HNP4對(duì)E.coli的抑制活性強(qiáng)于對(duì)S.aureus的抑制作用。所有HNP4精氨酸突變體對(duì)E.coli和S.aureus的活性均比HNP4低很多。但是對(duì)HNP4影響最大的是位于26位的苯丙氨酸。其相對(duì)應(yīng)的突變體F26A-HNP4對(duì)S.aureus的抑制作用幾乎完全喪失,但對(duì)E.colli的抑制作用沒有影響。二聚對(duì)HNP4抗革蘭氏陰性菌活性影響不大,但其革蘭氏陽性菌抑制活性下降約3倍。因此HNP4很有可能是采取兩種不同的機(jī)制來抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。氨基酸和結(jié)構(gòu)改變對(duì)HNP4抑制炭疽桿菌致死因子(LF)活性和結(jié)合gp120活性的影響:通過非線性回歸分析,發(fā)現(xiàn)同抑菌試驗(yàn)結(jié)果類似,26位的苯丙氨酸對(duì)HNP4的活性影響最大,精氨酸次之。HNP4的單體Me Leu20-HNP4對(duì)LF和gp120結(jié)合能力也明顯下降。上述研究結(jié)果表明對(duì)HNP4功能影響最大的是26位苯丙氨酸,其次是精氨酸。二聚也會(huì)影響HNP4的部分功能。總之,本研究發(fā)現(xiàn)了能抑制副豬嗜血桿菌和偽狂犬病毒的抗菌肽cecropin B和piscidin。同時(shí)通過HNP4結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究,發(fā)現(xiàn)了對(duì)HNP4功能活性影響最大的苯丙氨酸和精氨酸,獲得了研究抗菌肽結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的技術(shù)方法和思路。為進(jìn)一步研制抗豬源病原微生物的新型制劑及臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
【圖文】：

1 個(gè)氨基酸組成的 BuforinⅡ在數(shù)倍于 MIC 濃度時(shí)，不裂解細(xì)菌膜而殺通過 FITC 標(biāo)記發(fā)現(xiàn) BuforinⅡ在較低濃度下就能跨過細(xì)菌膜并在胞質(zhì)凝膠阻滯試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) BuforinⅡ能與核酸互作，并且活性比采用膜作用機(jī)Figure 1-2 Models for AMPs interacting with intracellular targets

圖 1-3 抗菌肽不同的抗病毒機(jī)制(Mulderet al 2013)Figure 1-3 Different models displayed by AMPs against viruses非脊椎動(dòng)物的抗菌肽：此類多肽如 melittin, alloferon 和 cecr種病毒具有強(qiáng)烈抑制作用。研究表明 melittin 對(duì) HIV-1 感染
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S859.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郭春和;焦茂興;何俊;劉德輝;黃毓茂;;抗菌肽Cecropin D基因在畢赤酵母中的表達(dá)與抗菌活性分析[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2011年11期

2 王愛蘋;汪以真;陳正賢;;豬抗菌肽cecropin-P1單克隆抗體的制備[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;2008年04期

3 丁兆忠;苗向陽;孫世鐸;;抗菌肽Cecropin P1基因表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2006年06期

4 王珍;姜建陽;祝發(fā)明;李麗;譙仕彥;;抗菌肽Cecropin AD在畢赤酵母中的組成型表達(dá)的研究[J];中國畜牧雜志;2010年05期

5 宋杰;陳維春;;斜紋夜蛾Cecropin D成熟肽的原核表達(dá)及活性檢測(cè)[J];昆蟲學(xué)報(bào);2007年12期

6 李建霞;苗向陽;丁兆忠;任慧英;于忠娜;;抗菌肽Cecropin P1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];中國畜牧獸醫(yī);2007年09期

7 章玉萍;牛曉利;曹玉橋;范濤;代君君;王儲(chǔ)言;吳傳華;劉健;;家蠶抗菌肽Cecropin D基因的原核表達(dá)、純化及抑菌活性測(cè)定[J];中國蠶業(yè);2011年04期

8 溫劉發(fā);金云行;黃達(dá)華;黃國慶;;高劑量Cecropin AD對(duì)10-20kg階段仔豬的飼用效果[J];中國動(dòng)物保健;2008年10期

9 ;Cecropin B gene transformed rice (Oryza sativa L.) plants show improved resistance to rice bacterial diseases[J];Chinese Rice Research Newsletter;1995年02期

10 唐麗云;郭春和;鄭紅玉;項(xiàng)林盛;劉德輝;黃毓茂;焦茂興;;重組抗菌肽Cecropin P1在畢赤酵母X-33中的表達(dá)以及純化后的生物活性分析[J];華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前4條

1 ;Study of high-level expression of Musca domestica cecropin with partner molecular in Escherichia coli[A];格萊姆抗菌肽——抗菌肽開發(fā)與應(yīng)用技術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

2 陳香;譙仕彥;祝發(fā)明;曹云鶴;;一種高效表達(dá)抗菌肽Cecropin AD的枯草芽孢桿菌基因工程菌株的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物抗菌活力的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2009學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2009年

3 王秀青;曹瑞兵;周斌;陳溥言;;Cecropin B基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)以及生物活性的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第六屆理事會(huì)第二次會(huì)議暨教學(xué)專業(yè)委員會(huì)第六屆代表大會(huì)論文集[C];2006年

4 宋雪瑩;馮興軍;李靜;許文杉;;雜合抗菌肽LfcinB-Cecropin在大腸桿菌中的高效表達(dá)及其活性鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)分會(huì)第十一次全國動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 胡翰;α螺旋抗菌肽與α防御素4抗病原微生物活性及作用機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 鄭青;新型抗菌肽基因的設(shè)計(jì)、合成與表達(dá)研究[D];華南理工大學(xué);1997年

3 李小永;Cecropin B-LHRH'重組基因的構(gòu)建表達(dá)及其抑癌功能[D];吉林大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 徐建;表達(dá)豬β防御素-2和cecropin P1抗菌肽枯草芽孢桿菌的構(gòu)建及特性研究[D];燕山大學(xué);2016年

2 陳婉嫻;抗菌肽Cecropin P1在畢赤酵母中的表達(dá)與活性研究[D];華東理工大學(xué);2011年

3 李巍;重組豬蛔蟲抗菌肽Cecropin P1在畢赤酵母中的表達(dá)及抑菌活性的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 翟瓊;抗菌肽cecropin P1在大腸桿菌中的表達(dá)純化與測(cè)活[D];華東理工大學(xué);2011年

5 韓玉萍;抗菌肽Cecropin X基因的克隆及其在大腸桿菌中的融合表達(dá)[D];四川大學(xué);2006年

6 尹娜;抗菌肽Cecropin D的表達(dá)、純化及其體外活性鑒定[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

7 費(fèi)媛媛;Cecropin P2、Cecropin A及溶菌酶-Cecropin A融合蛋白的表達(dá)及抑菌活性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

8 張?zhí)m廷;新疆家蠶抗菌肽的分子改造及其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系[D];新疆大學(xué);2008年

9 胡仲秋;一種新型抗菌肽Cecropin B基因的設(shè)計(jì)、合成及在畢赤酵母中的表達(dá)[D];西北大學(xué);2005年

10 楊瑩;家蠶和果蠅的抗菌肽Cecropin B基因的表達(dá)及產(chǎn)物抑菌活性分析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

，

本文編號(hào)：2571416