本文關(guān)鍵詞：綿羊骨骼肌高表達(dá)miRNA靶基因的高通量獲取及部分候選靶基因生物功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：為了掌握綿羊骨骼肌中mi RNA的表達(dá)情況,深入探索其在綿羊骨骼肌發(fā)育過程中的表達(dá)特點(diǎn)及靶向調(diào)控的基因,進(jìn)一步闡明miRNA對(duì)綿羊骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機(jī)制,為優(yōu)質(zhì)肉羊品種的培育提供理論基礎(chǔ)及新的育種手段。本研究首先以薩福克羊骨骼肌為材料,使用芯片技術(shù)對(duì)其骨骼肌中miRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè),并以此為基礎(chǔ)對(duì)綿羊骨骼肌中高表達(dá)miRNA從以下4個(gè)方面開展了深入研究:首先,使用PCR-SSCP(Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism)技術(shù)對(duì)綿羊骨骼肌中高表達(dá)miRNA前體序列在4個(gè)不同產(chǎn)肉性能綿羊品種中的突變進(jìn)行檢測(cè),尋找在不同產(chǎn)肉性能綿羊品種間差異較大的突變,分析相關(guān)突變與綿羊產(chǎn)肉性能之間的關(guān)系。選擇7個(gè)對(duì)miRNA前體序列二級(jí)結(jié)構(gòu)能值影響不同的突變,構(gòu)建真核表達(dá)載體,通過真核細(xì)胞表達(dá)試驗(yàn)及qRT-PCR檢測(cè)其對(duì)miRNA加工成熟的影響;其次,使用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)綿羊骨骼肌中高表達(dá)miRNA在綿羊胚胎期第40 d、60 d、80 d、100 d、120 d以及初生、6月齡和周歲綿羊骨骼肌組織中的表達(dá)變化,并分析其與綿羊骨骼肌發(fā)育之間的關(guān)系;第三,使用本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的建庫技術(shù),構(gòu)建綿羊胚胎期第60 d和成年羊骨骼肌中高表達(dá)miRNA的靶基因文庫;第四,以綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為材料,采用qRT-PCR和Western Blot技術(shù)研究miR-133過表達(dá)和抑制表達(dá)對(duì)綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長以及miR-133的4個(gè)候選靶基因表達(dá)的影響,分析miR-133對(duì)綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長的調(diào)控作用。通過以上試驗(yàn),本研究得到了以下結(jié)果:1.利用芯片技術(shù)在綿羊骨骼肌中共檢測(cè)到261個(gè)miRNA,其中58個(gè)為已報(bào)道的綿羊miRNA,其余203個(gè)在綿羊中尚未見報(bào)道;且這261個(gè)miRNA在同時(shí)期綿羊骨骼肌中的表達(dá)量不盡相同,其中有22個(gè)高表達(dá)的miRNA,其表達(dá)量占檢測(cè)到mi RNA總表達(dá)量的89%;2.首次在16個(gè)miRNA前體序列中檢測(cè)到共計(jì)49個(gè)突變,其中包括41個(gè)單堿基突變和8個(gè)插入/缺失突變,另有6個(gè)miRNA前體序列沒有檢測(cè)到突變;對(duì)其中的3個(gè)突變?cè)?個(gè)產(chǎn)肉性能不同的綿羊品種共計(jì)640份基因組樣品中進(jìn)行了進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)miR-133a前體序列的CCC插入/缺失突變與綿羊的產(chǎn)肉性狀高度相關(guān);89.8%的突變對(duì)miRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)和成熟加工有影響,且突變對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)能值影響越大,突變位置離miRNA成熟序列越近,對(duì)miRNA的成熟加工影響亦越大;3.綿羊骨骼肌中22個(gè)高表達(dá)miRNA在綿羊骨骼肌發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)上調(diào)或者下調(diào),其表達(dá)量按照4種基本的模式發(fā)生變化。胚胎期大部分mi RNA出現(xiàn)了兩個(gè)低表達(dá)期,分別是胚胎期的40 d至60 d和120 d;4.分別成功構(gòu)建了綿羊胚胎期和成年期骨骼肌高表達(dá)miRNA靶基因文庫。胚胎期文庫和成年期文庫分別測(cè)序250個(gè)單克隆,得到246條和239條有效序列,陽性克隆率分別達(dá)到85%和79%。分別有132條和124條ESTs序列與NCBI中unigene序列匹配,占靶基因文庫的53.66%和51.88%;5.mi R-133過表達(dá)對(duì)綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖具有抑制作用;miR-133在綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中可靶向調(diào)控Rhoa,CDC42,TAGLN2基因的表達(dá),造成其蛋白表達(dá)量極顯著下調(diào),但是對(duì)MSN基因沒有調(diào)控作用。miR-133在Rhoa和TAGLN2的CDS區(qū)分別有一個(gè)靶位點(diǎn),其余靶位點(diǎn)均位于3’UTR區(qū)。通過上述研究,對(duì)綿羊骨骼肌中miRNA的表達(dá)情況及其靶基因有了較為全面的認(rèn)識(shí),對(duì)骨骼肌不同發(fā)育階段miRNA的表達(dá)變化情況及其功能有了更為深入的掌握。以上研究工作將為進(jìn)一步闡明綿羊骨骼肌發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ),為優(yōu)質(zhì)肉羊品種的培育提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)及新的育種手段,將對(duì)肉羊育種工作產(chǎn)生積極地推動(dòng)作用。
【關(guān)鍵詞】：綿羊 骨骼肌 miRNA 靶基因
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S826
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略詞表(Abbreviations)10-11
• 引言11-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述 哺乳動(dòng)物 miRNA 與其靶基因作用機(jī)制研究進(jìn)展12-24
• 1.1 miRNA的轉(zhuǎn)錄及加工成熟12-13
• 1.2 miRNA與靶基因的結(jié)合13-14
• 1.2.1 動(dòng)物miRNA的“種子序列”13
• 1.2.2 miRNA 3’端序列對(duì)“種子序列”與靶位點(diǎn)結(jié)合的穩(wěn)固13-14
• 1.2.3 miRNA與其靶基因的結(jié)合位點(diǎn)14
• 1.3 miRNA基因的多態(tài)性對(duì)其加工成熟的影響14-15
• 1.4 miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控15-17
• 1.4.1 抑制mRNA翻譯起始15-16
• 1.4.2 翻譯起始后的調(diào)節(jié)16-17
• 1.4.3 miRNA調(diào)節(jié)mRNA的降解17
• 1.5 獲取miRNA靶基因的方法17-19
• 1.5.1 生物信息學(xué)分析的方法17-18
• 1.5.2 差異表達(dá)譜分析法18
• 1.5.3 miRISC免疫共沉淀法18-19
• 1.6 哺乳動(dòng)物肌肉miRNA及其靶基因研究進(jìn)展19-21
• 1.6.1 哺乳動(dòng)物肌肉miRNA研究進(jìn)展19-20
• 1.6.2 肌肉miRNA靶基因研究進(jìn)展20-21
• 1.7 哺乳動(dòng)物骨骼肌發(fā)育及其分子調(diào)控機(jī)制21-23
• 1.7.1 哺乳動(dòng)物胚胎期肌生成21-22
• 1.7.2 成年動(dòng)物肌肉組織的維持及修復(fù)22
• 1.7.3 肌生成的分子調(diào)控機(jī)制22-23
• 1.8 研究目的和意義23-24
• 第二章 綿羊骨骼肌中miRNA表達(dá)研究24-31
• 1. 材料與方法24-27
• 1.1 試驗(yàn)材料24-25
• 1.2 方法25-27
• 1.3 數(shù)據(jù)處理及分析27
• 2. 結(jié)果與分析27-29
• 2.1 總RNA提取質(zhì)量檢測(cè)27-28
• 2.2 綿羊骨骼肌中miRNA表達(dá)情況28
• 2.3 芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)的驗(yàn)證28-29
• 3. 討論29-30
• 4. 小結(jié)30-31
• 第三章 綿羊骨骼肌中高表達(dá)miRNA前體序列的多態(tài)性研究31-55
• 1. 材料與方法31-40
• 1.1 試驗(yàn)材料31-32
• 1.2 試驗(yàn)方法32-40
• 1.3 數(shù)據(jù)分析40
• 2. 結(jié)果與分析40-52
• 2.1 綿羊骨骼肌高表達(dá)miRNA前體序列突變40-42
• 2.2 miRNA前體序列突變的特點(diǎn)42-43
• 2.3 miRNA前體序列突變對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的影響43-46
• 2.4 序列突變?cè)诓煌a(chǎn)肉性能綿羊品種間的差異46-49
• 2.5 miRNA前體序列突變對(duì)其成熟加工的影響49-52
• 3. 討論52-54
• 3.1 綿羊骨骼肌高表達(dá)miRNA前體序列的突變52-53
• 3.2 miRNA前體序列突變與其成熟加工的關(guān)系53-54
• 4. 小結(jié)54-55
• 第四章 綿羊不同發(fā)育階段骨骼肌中miRNA表達(dá)情況研究55-66
• 1. 材料與方法55-59
• 1.1 試驗(yàn)材料55-56
• 1.2 方法56-59
• 1.3 數(shù)據(jù)分析59
• 2. 結(jié)果與分析59-64
• 2.1 骨骼肌總RNA提取及檢測(cè)59
• 2.2 22個(gè)綿羊骨骼肌高表達(dá)miRNA在不同發(fā)育階段骨骼肌中的表達(dá)情況59-62
• 2.3 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及其KEGG通路分析62-64
• 3. 討論64-65
• 4. 小結(jié)65-66
• 第五章 綿羊骨骼肌高表達(dá)miRNA靶基因的研究66-83
• 1. 材料與方法66-75
• 1.1 試驗(yàn)材料66-67
• 1.2 試驗(yàn)方法67-75
• 2. 結(jié)果與分析75-81
• 2.1 胚胎期和成年羊骨骼肌總RNA大劑量提取結(jié)果75
• 2.2 總RNA中混入基因組的消化及評(píng)估75-76
• 2.3 mRNA純化效果76-77
• 2.4 靶基因文庫的構(gòu)建及初步評(píng)估77-79
• 2.5 文庫陽性克隆挑選及菌落PCR鑒定79
• 2.6 靶基因文庫測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析79-81
• 3. 討論81-82
• 4. 小結(jié)82-83
• 第六章 miR-133對(duì)綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞生長的影響及其靶基因的驗(yàn)證83-98
• 1. 材料與方法83-90
• 1.1 試驗(yàn)材料83-85
• 1.2 試驗(yàn)方法85-89
• 1.3 數(shù)據(jù)分析89-90
• 2. 結(jié)果與分析90-94
• 2.1 綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染90
• 2.2 miR-133對(duì)綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長的影響90-91
• 2.3 miR-133對(duì)綿羊骨骼肌中4個(gè)候選靶基因表達(dá)的影響91-94
• 3. 討論94-97
• 3.1 綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的生長特性及轉(zhuǎn)染特性94-95
• 3.2 miR-133對(duì)綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞基因的靶向調(diào)控95-97
• 4. 小結(jié)97-98
• 結(jié)論98-99
• 創(chuàng)新點(diǎn)99-100
• 參考文獻(xiàn)100-110
• 致謝110-111
• 附錄111-114
• 作者簡(jiǎn)介114-115
• 附件115

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