本文關(guān)鍵詞：BBTV抗菌蛋白與血藍(lán)蛋白抗菌肽的抑菌活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在動植物中,抗菌肽(AMP)是抵御微生物入侵的重要屏障,在先天性免疫中扮演重要角色�？咕膩碓簇S富,許多抗菌資源還有待于開發(fā)利用,尤其高效的抗真菌肽(或蛋白)還鮮有報道。農(nóng)作物上由土傳尖孢鐮刀菌引起的枯萎病危害嚴(yán)重,目前尚無長期有效的防控手段。特別是由尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種(Foc-TR4)引起的香蕉枯萎病在世界香蕉產(chǎn)區(qū)流行,威脅到80%的香蕉產(chǎn)量。在此,鑒于束頂病植株具有抗枯性,則暗示BBTV對以維管束組織為共侵染點的Foc產(chǎn)生拮抗。本論文進(jìn)一步研究表明BBTV的基因沉默抑制子B4(特異地定位于維管束組織的細(xì)胞外膜上)賦予對Foc的拮抗作用。純化的B4蛋白在體外有效(90%)抑制Foc分生孢子萌發(fā)和菌絲生長。并且,B4GFP轉(zhuǎn)基因番茄在整個生育期對尖孢鐮刀菌番茄專化型(Fo1)具備良好抗性。在對Fol脅迫下的野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行基因差異表達(dá)譜分析,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的光合系統(tǒng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)大幅度(50×)上調(diào),而植物與病原物互作(或免疫相關(guān))相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平呈下調(diào)的,這可能是B4蛋白阻抑Foc的入侵未能使得寄主大量激活效應(yīng)子觸發(fā)的免疫(ETI)。BBTV對尖孢鐮刀菌的拮抗為病原微生物菌群在單一植物中的動態(tài)演化提供一個新范例。另外,細(xì)菌病也嚴(yán)重影響農(nóng)作物生產(chǎn),尤其是由細(xì)菌耐藥性給病害防控所帶來的問題�？咕耐ǔ０邢蜃饔眉�(xì)菌質(zhì)壁組分,可有效降低病原細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。無脊椎動物生物(如節(jié)肢動物和軟體動物)在微生物環(huán)境活動,體內(nèi)一般以抗菌肽防御細(xì)菌入侵。節(jié)肢動物的血藍(lán)蛋白(載氧蛋白,也是先天性免疫分子)已被證實為抗菌肽前體,但軟體動物的還未見報道。本論文發(fā)現(xiàn)候選抗菌肽(命名為haliotisin),來自軟體動物鮑(Haliotis tuberculata)血藍(lán)蛋白Ⅰ型亞基(HtH1)的功能體FU-E中連接α螺旋結(jié)構(gòu)域和β片層結(jié)構(gòu)域的linker序列,位于血藍(lán)蛋白中空圓柱體顆粒的中心部位內(nèi)壁上。通過合成重疊肽進(jìn)行抗菌測試表明多肽P3-P4-P5(DTFDYKKFGYRY DSLELE GRSISRIDELIQQRQEKDRTFAGFLLKGFGTSAS)兼具對革蘭氏陽性菌(B.subtilis)和陰性菌(E.carotovora)的抗性,且對陽性菌抑制活性甚高；經(jīng)抗菌肽處理后的細(xì)菌經(jīng)電鏡觀察,其細(xì)胞質(zhì)壁損傷嚴(yán)重。鮑血藍(lán)蛋白作為新型廣譜抗菌肽的來源,其作用機(jī)理有待于繼續(xù)研究。本論文首次鑒定了病毒源的候選抗真菌蛋白B4以及源自軟體動物血藍(lán)蛋白的抗細(xì)菌肽(haliotisin),這兩者都屬于抗菌免疫分子,分別為抗枯和抗細(xì)菌轉(zhuǎn)基因育種提供新的抗性資源。
【關(guān)鍵詞】：香蕉束頂病毒 尖孢鐮刀菌 拮抗 B4蛋白 鮑血籃蛋白 抗菌肽 先天性免疫
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S436.68
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 引言11-12
• 第一章 香蕉束頂病毒B4蛋白拮抗尖孢鐮刀菌的分析12-47
• 1 前言12-25
• 1.1 香蕉束頂病毒12-19
• 1.1.1 香蕉束頂病毒的典型致病特征12-13
• 1.1.2 香蕉束頂病的發(fā)生、傳播方式及病害流行13-14
• 1.1.3 感病植株的細(xì)胞病理學(xué)特性及變化14
• 1.1.4 BBTV粒體形態(tài)及其分類地位14-15
• 1.1.5 BBTV的基因組結(jié)構(gòu)及其各組分編碼蛋白15-17
• 1.1.6 植物病毒抑制寄主RNA沉默的策略及BBTV基因沉默抑制子的特征17-19
• 1.2 香蕉枯萎病的危害及其防控策略19-25
• 1.2.1 香蕉枯萎病的典型癥狀及其病原尖孢鐮刀菌19-21
• 1.2.2 香蕉枯萎病的防控策略21-22
• 1.2.3 抗性基因的導(dǎo)入和寄主誘導(dǎo)的基因沉默(HIGS)是抗真菌的有效方式22-25
• 2 材料與方法25-32
• 2.1 材料與試劑25
• 2.1.1 香蕉束頂病毒毒源和本氏煙25
• 2.1.2 菌種與質(zhì)粒25
• 2.1.3 試劑25
• 2.2 實驗方法25-32
• 2.2.1 序列比對25
• 2.2.2 蛋白B4的表達(dá)和純化25-26
• 2.2.3 熒光抗體的交聯(lián)26
• 2.2.4 B4抗血清的制備及其抗體IgG的純化26-27
• 2.2.5 PVX重組載體的構(gòu)建以及農(nóng)桿菌浸潤本氏煙27-28
• 2.2.6 植物總蛋白提取及western blot分析28
• 2.2.7 透射電鏡觀察28
• 2.2.8 B4蛋白體外拮抗Foc的活性分析28-29
• 2.2.9 植物表達(dá)載體的構(gòu)建和番茄轉(zhuǎn)化29
• 2.2.10 DEG(差異表達(dá)基因)的文庫構(gòu)建及其差異聚類分析29-31
• 2.2.11 定量PCR驗證分析31-32
• 3 結(jié)果與分析32-43
• 3.1 感染BBTV的香蕉增強(qiáng)對Foc-TR4的拮抗性33
• 3.2 B4蛋白一級序列分析及原核表達(dá)33-35
• 3.3 B4蛋白體外拮抗尖孢鐮刀菌35-36
• 3.4 B4蛋白的體內(nèi)細(xì)胞定位36-38
• 3.5 蛋白B4賦予轉(zhuǎn)基因番茄對尖孢鐮刀菌Fol的抗性38
• 3.6 B4GFP轉(zhuǎn)基因番茄與野生型番茄的差異表達(dá)譜及RT-qPCR驗證38-43
• 4 討論43-47
• 第二章 鮑血籃蛋白抗菌肽對細(xì)菌的抑制分析47-71
• 1 前言47-59
• 1.1 軟體動物血藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)特征及其功能47-51
• 1.2 鮑血藍(lán)蛋白應(yīng)答病原物侵染的先天性免疫51-57
• 1.3 三維重構(gòu)技術(shù)簡介57-59
• 1.3.1 中央截面定理57-58
• 1.3.2 cryo-EM三維重構(gòu)的方法及流程58-59
• 2 材料與方法59-61
• 2.1 材料與試劑59
• 2.1.1 多肽和測試菌株59
• 2.1.2 試劑59
• 2.2 實驗方法59-61
• 2.2.1 多肽的合成及溶解59
• 2.2.2 血藍(lán)蛋白功能體FU-E的生信預(yù)測及序列比對59-60
• 2.2.3 FU-E的3D結(jié)構(gòu)同源模建60
• 2.2.4 抗菌分析60-61
• 3 結(jié)果與分析61-68
• 3.1 血藍(lán)蛋白功能體FU-E候選抗菌肽的保守性分析61-62
• 3.2 Haliotisin的抗菌活性分析62-65
• 3.3 Haliotisin結(jié)構(gòu)分析65-68
• 4 討論68-71
• 全文總結(jié)與展望71-73
• 參考文獻(xiàn)73-81
• 致謝81-82
• 已發(fā)表(或接受發(fā)表)的相關(guān)論文82

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9 曾桂娣;黃曉成;范玉蘭;薛s，

本文編號：254207