【摘要】：翻譯后修飾在真核生物中發(fā)揮著重要作用,小泛素相關(guān)修飾物SUMO(small ubiquitin-related modifier)是真核生物中一種重要的翻譯后修飾。在SUMO結(jié)合底物的過程中有三種酶參與,分別是E1(激活酶)、E2(結(jié)合酶)、E3(連接酶)。植物SIZ1作為一種E3連接酶,促進底物和目標蛋白的結(jié)合。SIZ1調(diào)控逆境脅迫下產(chǎn)生的SUMO結(jié)合。目前已在擬南芥、水稻、石斛蘭以及蘋果等植物中發(fā)現(xiàn)SIZ1蛋白的存在。但是,對于唯一的木本植物蘋果中的MdSIZ1還并沒有進行作用機理的研究。在本研究中,我們對蘋果中的MdSIZ1的功能及其調(diào)控的生理過程進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)蘋果中的MdSIZ1可以在體內(nèi)和體外發(fā)揮SUMO E3連接酶的作用。低溫、高溫、以及脫落酸處理會導致蘋果組培苗體內(nèi)SUMO結(jié)合水平提高。在擬南芥突變體siz1-2中異位表達MdSIZ1,部分恢復了擬南芥的缺陷表型以及SUMO結(jié)合水平。研究證明,MdSIZ1與At SIZ1具有類似的功能,并且MdSIZ1介導的SUMO化在調(diào)控植物適應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用。在擬南芥中AtSIZ1調(diào)控缺磷脅迫。本研究發(fā)現(xiàn),在缺磷處理的組培苗中,MdSIZ1的表達量和SUMO結(jié)合水平明顯提高。蘋果中,缺磷誘導的MYB轉(zhuǎn)錄因子MdPHR1被SUMO化修飾。異位表達MdSIZ1基因部分恢復了擬南芥突變體siz1-2在缺磷條件下的突變表型。研究還發(fā)現(xiàn),在缺磷條件下突變體siz1-2的存活率與野生型相比明顯下降,而異位表達MdSIZ1基因部分恢復了這種存活率下降的現(xiàn)象。為驗證MdSIZ1在蘋果缺磷脅迫的作用,我們使用過量表達和沉默表達的MdSIZ1轉(zhuǎn)基因愈傷組織進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺磷條件下,過表達MdSIZ1的愈傷組織與野生型相比鮮重提高,而沉默表達MdSIZ1的愈傷組織在缺磷條件下無法生長。研究證明,MdSIZ1過表達提高了蘋果對缺磷脅迫的耐受性。在蘋果中,果實色澤是一種重要的外觀品質(zhì)性狀,而花青苷是決定蘋果果實顏色的重要次生代謝產(chǎn)物,花青苷的合成受溫度、光照、營養(yǎng)物質(zhì)以及植物激素的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子MdMYB1在調(diào)控花青苷合成方面發(fā)揮重要作用,用MdMYB1進行酵母雙雜交篩庫,對陽性克隆的測序結(jié)果表明,MdMYB1可能與MdSIZ1相互作用,隨后,二者的相互作用被酵母雙雜、Pull-Down、Co-IP試驗所證明。隨后的研究表明,MdSIZ1作為SUMO E3連接酶調(diào)控MdMYB1的SUMO化,被SUMO化修飾的MdMYB1蛋白穩(wěn)定性提高,防止其被26S蛋白酶體降解;另外,研究發(fā)現(xiàn),在愈傷和蘋果果實中MdSIZ1通過SUMO化MYB1調(diào)控花青苷的合成。綜上所述,MdSIZ1在蘋果適應(yīng)逆境脅迫以及調(diào)節(jié)次生代謝方面都發(fā)揮重要作用,因此研究MdSIZ1的分子機制對于提高蘋果的抗性和改善蘋果的品質(zhì)具有一定的指導意義。
[Abstract]:Post-translation modification plays an important role in eukaryotes. SUMO (small ubiquitin-related modifier (ubiquitin related modifier) is an important post-translation modification in eukaryotes. There are three enzymes involved in the process of SUMO binding substrate, namely E1 (activating enzyme), E2 (binding enzyme) and E3 (ligase). Plant SIZ1, as an E3 ligase, promotes the binding of substrate to target protein. Siz1 regulates SUMO binding under stress. SIZ1 protein has been found in Arabidopsis, rice, Dendrobium and apple. However, the mechanism of MdSIZ1 in apple, the only woody plant, has not been studied. In this study, we studied the function of MdSIZ1 in apple and the physiological process of its regulation. It has been found that MdSIZ1 in apple can play the role of SUMO E3 ligase in vivo and in vitro. Low temperature, high temperature and abscisic acid treatment can lead to the increase of SUMO binding level in apple tissue culture seedlings. The ectopic expression of MdSIZ1, in Arabidopsis mutant siz1-2 partially restored the defective phenotype and SUMO binding level of Arabidopsis thaliana. It has been proved that MdSIZ1 and At SIZ1 have similar functions, and MdSIZ1 mediated Sumo plays an important role in regulating plant adaptation to stress. AtSIZ1 regulated phosphorus deficiency stress in Arabidopsis thaliana. In this study, it was found that the expression of MdSIZ1 and the level of SUMO binding were significantly increased in the tissue culture seedlings treated with phosphorus deficiency. In apple, MYB transcription factor MdPHR1 induced by phosphorus deficiency was modified by sumo. Ectopic expression of MdSIZ1 gene partially restored the mutant phenotype of Arabidopsis mutants siz1-2 under phosphorus deficiency. It was also found that the survival rate of mutant siz1-2 was significantly lower than that of wild type under the condition of phosphorus deficiency, while the ectopic expression of MdSIZ1 gene partially restored the decrease of survival rate. In order to verify the effect of MdSIZ1 on phosphorus deficiency stress in apple, we studied MdSIZ1 transgenic calli with overexpression and silencing expression. The results showed that under the condition of phosphorus deficiency, the fresh weight of calli overexpressing MdSIZ1 was higher than that of wild type, while the calli silent expressing MdSIZ1 could not grow under the condition of phosphorus deficiency. It has been proved that the overexpression of MdSIZ1 improves the tolerance of apple to phosphorus deficiency stress. In apple, fruit color is an important appearance quality trait, and anthocyanin is an important secondary metabolite that determines apple fruit color. Anthocyanin synthesis is regulated by temperature, light, nutrients and plant hormones. Transcription factor MdMYB1 plays an important role in regulating anthocyanin synthesis. Yeast two-hybrid screening library was carried out with MdMYB1. The sequencing results of positive clones showed that MdMYB1 might interact with MdSIZ1, and then the interaction between MdMYB1 and Pull-Down, was double hybrid by yeast. As proved by Co-IP test. Subsequent studies showed that MdSIZ1, as a SUMO E3 ligase, regulated the summatization of MdMYB1, and the stability of MdMYB1 protein modified by sumo was improved to prevent its degradation by 26s proteasome. In addition, it was found that MdSIZ1 regulated anthocyanin synthesis through sumo MYB1 in calli and apple fruit. To sum up, MdSIZ1 plays an important role in apple adaptation to stress and regulation of secondary metabolism, so the study of the molecular mechanism of MdSIZ1 has certain guiding significance for improving apple resistance and improving apple quality.
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S661.1

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