【摘要】：武香S是本實驗室培育成的一種新型無花粉型的光溫敏核不育系水稻,其具有不育起點溫度低、高配合力和形態(tài)學(xué)標記等特點。本研究以武香S(WXS)為材料,首先對其不育位點、細胞學(xué)和光溫處理表型進行檢測和觀察；接著,利用MSAP和cDNA-AFLP以及高通測序方法對其表觀遺傳調(diào)控機制進行了初步研究。主要研究結(jié)果如下：1、通過MSAP和cDNA-AFLP兩種分子生物學(xué)技術(shù),研究了武香S在育性轉(zhuǎn)換期基因組DNA甲基化譜和轉(zhuǎn)錄本變化。結(jié)果表明：在幼穗和葉片中,分別檢測到2561和2570個CCGG位點,同時也分別檢測出1630和1409個轉(zhuǎn)錄本片段。相對于不育株武香S(S, Sterility, WXS-S),在可育株(F, Fertility, WXS-F)的幼穗和葉片中,甲基化水平分別下降了0.24%和0.16%,轉(zhuǎn)錄本水平分別提高了0.53%和1.44%。表現(xiàn)出甲基化總體水平與轉(zhuǎn)錄水平呈負相關(guān)。分別從11類甲基化/去甲基化類型中選取了28個差異片段,從15類轉(zhuǎn)錄本變化類型中選取了23個差異片段,經(jīng)克隆測序和基因注釋、GO分析富集分析顯示這些基因多為環(huán)境脅迫相關(guān)基因。選取了8個具有代表性的差異片段進行qPCR驗證,結(jié)果也表明甲基化片段甲基化狀態(tài)與基因表達水平呈負相關(guān),而轉(zhuǎn)錄本片段出現(xiàn)或者缺失與其表達水平呈正相關(guān),說明這些功能基因可能在光溫育性轉(zhuǎn)換中具有重要的功能。2、利用高通測序的技術(shù)比較分析了武香S在不育條件和可育條件下幼穗的miRNA的表達差異,在WXS-S和WXS-F中共發(fā)現(xiàn)72個miRNA存在差異表達。其中,SP2-FP2組中有55個差異表達的小RNA,SP3-FP3組中有51個差異表達的小RNA,合并分析有26個miRNA在兩組中均表現(xiàn)出了差異,其中11個已知microRNA在不育系中均表現(xiàn)為顯著差異下調(diào)表達,15個在不育系中均表現(xiàn)為顯著差異上調(diào)表達。差異表達miRNA的靶標包含了核糖體失活蛋白、抗病蛋白、MYB家族蛋白、轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)座子以及鋅指蛋白等。研究表明miRNA 廣泛地參與包括信號傳導(dǎo)、發(fā)育調(diào)節(jié)、脅迫應(yīng)答和組成細胞學(xué)組成成分等生物學(xué)過程。此外,還發(fā)現(xiàn)在育性轉(zhuǎn)換過程中存在這大量的miRNA編輯事件,編輯主要發(fā)生在miRNA的11位和18位上,5’端的1-3位和miRNA核心保守區(qū)域8-10位未發(fā)現(xiàn)編輯,這說明miRNA編輯在維持miRNA功能穩(wěn)定的同時也豐富了其調(diào)控方式的多樣性。3. lncRNA轉(zhuǎn)錄組測序初步研究表明：93%的lncRNA起源于基因組基因間區(qū)和反義鏈上,在染色體體上均勻分布,其中有2/3的lncRNA其長度分布在200-1000bp范圍,同時,lncRNA表現(xiàn)出組織和發(fā)育階段特異表達的特性；表達量水平密度分析顯示,lncRNA與mRNA具有相近的表達水平；差異表達分析顯示,花粉母細胞形成期WXS-F有1596條lncRNAs發(fā)生上調(diào)表達,1053條lncRNAs下調(diào)表達；減數(shù)分裂時期WXS-F有1195條lncRNAs發(fā)生上調(diào)表達,334條下調(diào)表達；lncRNA偽靶標預(yù)測顯示,有238個lncRNA可作為miRNA的內(nèi)源偽靶標；miRNA的合成前體的預(yù)測表明,有22個高度信任的lncRNA可作為26個成熟體]miRNA合成前體；lncRNA與mRNA共表達分析表明,1873條差異表達的lncRNA對應(yīng)的順式調(diào)控(Cis-regulaiton)靶標有10739條,反式調(diào)控(Trans-regultion)靶標有1100條；從顯著性GO通路中,共篩選到了32個候選lncRNA可能參與了花粉發(fā)育相關(guān)通路的調(diào)節(jié)。4、在MSAP-seq方法建立過程中,選用了EcoRI/MspⅠ和EcoRI/HapⅡ兩種酶切組合對樣本進行DNA酶切,并設(shè)計兼容Illumina二代測序儀的引物進行接頭連接和混樣PCR。MSAP-seq分析結(jié)果顯示,本研究設(shè)計的建庫方法適合進行高通量測序,數(shù)據(jù)的質(zhì)量、插入片段長度和測序深度也適合進行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。以水稻9311和武香S幼穗樣本為例,數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理后,共產(chǎn)生14304個可供分析的胞嘧啶甲基化狀態(tài)位點。C位點狀態(tài)模式比較分析,共篩選到142個與光溫育性相關(guān)的甲基化C位點,利用Annovar軟件將性狀相關(guān)的差異甲基化位點定位到具體的基因區(qū)域或最近基因,總共關(guān)聯(lián)到40個基因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S511

【參考文獻】

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