本文關(guān)鍵詞：宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47對PEDV復(fù)制影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動(dòng)物傳染病學(xué)分會第十六次學(xué)術(shù)研討會論文集》2015年

豬流行性腹瀉病毒S蛋白主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)及間接ELISA檢測方法的建立

華耀  王瑋  李郁  孫裴  魏建忠  

【摘要】：引言豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種以腹瀉、嘔吐、脫水和哺乳仔豬高致死率為主要特征的高度接觸性腸道傳染病。自2010年10月以來,PED在我國的流行廣泛并呈現(xiàn)新的特點(diǎn),感染PEDV后,哺乳仔豬死亡率達(dá)80%~100%,而繁殖母豬和公豬則很少表現(xiàn)出臨床癥狀。建立快速、可靠的PEDV抗體檢測方法,進(jìn)行PED流行病學(xué)的監(jiān)測以及豬群免疫過PED疫苗后抗體水平的檢測,對于本病的預(yù)防具有重要意義。PEDVS蛋白是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,且產(chǎn)生的抗體水平持續(xù)時(shí)間長,因此S蛋白可作為可靠的檢測抗原。本研究以表達(dá)的S蛋白為包被抗原建立間接ELISA檢測方法,為PEDV抗體檢測試劑盒的研發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。材料與方法利用生物學(xué)軟件對PEDV S蛋白進(jìn)行抗原位點(diǎn)分析,選擇S蛋白的主要抗原表位區(qū),利用RT-PCR擴(kuò)增S基因,然后重組至表達(dá)載體pET-32a(+)中,構(gòu)建重組pET(+)-32a-S原核表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行S蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化并采用SDS-PAGE和Western-blot對重組蛋白進(jìn)行鑒定及抗原性分析。用純化的重組S蛋白作為包被抗原,摸索間接ELISA檢測方法的抗原包被濃度、一抗的稀釋倍數(shù)、一抗的作用時(shí)間、封閉液的種類、二抗的稀釋倍數(shù)、二抗的作用時(shí)間及顯色時(shí)間。并通過特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)以及與商品化PEDV抗體檢測試劑盒和Western-blot對比試驗(yàn)進(jìn)一步確定所建立間接ELISA檢測方法的可行性。結(jié)果與討論成功表達(dá)了重組S蛋白,重組的S蛋白能與PEDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),并成功建立一種基于重組S蛋白的間接ELISA檢測方法,優(yōu)化的反應(yīng)條件為:蛋白包被濃度為8mg/L,一抗的稀釋倍數(shù)為1:40,一抗的作用時(shí)間是30min,最佳的封閉液時(shí)2%BSA,二抗的最佳稀釋度為1:1500,的作用時(shí)間是45 min,顯色時(shí)間是10 min。組內(nèi)及組間變異系數(shù)均小于10%,重復(fù)性較好。建立的間接ELISA方法與商品化的ELISA抗體檢測盒對比試驗(yàn)顯示兩者符合率為86.67%,敏感性為89.83%,特異性為82.62%;建立的間接ELISA方法Western-blot對比試驗(yàn)顯示兩者符合率為88.89%,敏感性為90.20%,特異性為83.33%。本研究的建立基于PEDV S蛋白的間接ELISA方法,具有良好的重復(fù)性,特異性,敏感性,并可能在臨床上成為檢測豬群中PEDV抗體水平及監(jiān)測PED流行情況的有效方法。

【作者單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院
【分類號】：S852.65
【正文快照】：

豬流行性腹瀉病毒S蛋白主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)及間接ELISA檢測方法的建立@華耀$安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院!合肥230036 @王瑋$安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院!合肥230036 @李郁$安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院!合肥230036 @孫裴$安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院!合肥230036 @魏建忠$

下載全文更多同類文獻(xiàn)

PDF全文下載

CAJ全文下載

(如何獲取全文？ 歡迎：購買知網(wǎng)充值卡、在線充值、在線咨詢)

CAJViewer閱讀器支持CAJ、PDF文件格式，AdobeReader僅支持PDF格式

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 古洪浪;鄧勝朝;崔進(jìn);劉曉露;劉超;袁航;馬嵐;張桂紅;;豬流行性腹瀉病毒PEDV-GD12株的分離與鑒定[J];中國獸醫(yī)雜志;2013年11期

2 杜曉莉;王一成;吳潤;徐麗華;袁秀芳;李軍星;周曉麗;;2010—2013年浙江省豬流行性腹瀉病毒臨床檢測及PEDV-S基因型分析[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2014年03期

3 鄧祖麗穎;陳陸;;豬流行性腹瀉病毒巢式RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年01期

4 李寶賢;馬廣鵬;葛俊偉;李一經(jīng);;豬流行性腹瀉病毒功能性受體的鑒定[J];病毒學(xué)報(bào);2009年03期

5 ;Cloning the Structure Genes and Expression the N Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus DX[J];Virologica Sinica;2009年03期

6 喬憲鳳,熊忠良,華文君,鄭新民;PEDV膜蛋白基因RT-PCR最適反應(yīng)條件的確立[J];湖北畜牧獸醫(yī);2001年01期

7 高慎陽;王珅;周鐵忠;李一經(jīng);;PEDV M蛋白N端的1～20aa的序列結(jié)構(gòu)與功能分析[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2010年15期

8 ;豬的運(yùn)輸過程是豬流行性腹瀉病毒傳播源頭之一[J];養(yǎng)殖與飼料;2014年04期

9 鄭逢梅;趙軍;霍金耀;李歡;楊霞;陳陸;常洪濤;王新衛(wèi);劉紅英;杜季梅;姚慧霞;王川慶;;PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表達(dá)及ELISA方法的建立[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年03期

10 孫東波;朗洪武;時(shí)洪艷;陳建飛;崔曉辰;王承寶;佟有恩;馮力;;PEDV S蛋白B細(xì)胞抗原表位的篩選和鑒定[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2007年09期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 余麗蕓;侯喜林;;Development and Evalutaion of Enzyme-Linked mmunosorbent Assay Based on Recombinant Nucleocapsid Protein for Detection of Porcine Epidemic Diarrhea (PEDV) Antibodies[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜寄生蟲學(xué)分會第五次代表大會暨第八次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

2 孫東波;馮力;時(shí)洪艷;陳建飛;;豬流行性腹瀉病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第七次研討會論文集[C];2008年

3 孫東波;朗洪武;時(shí)洪艷;陳建飛;崔曉辰;王承寶;佟有恩;馮力;;PEDV S蛋白B細(xì)胞抗原表位的篩選和鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第七次研討會論文集[C];2008年

4 鄭逢梅;趙軍;霍金耀;李歡;楊霞;常洪濤;杜季梅;王曉夢;王川慶;;PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表達(dá)及ELISA方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

5 ;Identification of two novel B cell epitopes on porcine epidemic diarrhea virus spike protein[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第七次研討會論文集[C];2008年

6 ;Spike protein region (aa 636～789) of porcine epidemic diarrhea virus is essentIal for induction of neutralizing antibodies[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第七次研討會論文集[C];2008年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 石達(dá);宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47對PEDV復(fù)制影響[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 畢靜;豬流行性腹瀉病毒AJ1102株的分離、鑒定及其分子進(jìn)化特征[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 葛俊偉;豬流行性腹瀉病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白不同抗原片段在重組干酪乳桿菌中的表達(dá)及其免疫學(xué)評價(jià)[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張百靈;豬流行性腹瀉病毒（PEDV）木瓜樣蛋白酶功能研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2011年

2 石明明;豬流行性腹瀉病毒（PEDV）及其抗體檢測方法的研究與應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 徐天;豬IEC酵母cDNA文庫的構(gòu)建及與PEDV結(jié)構(gòu)蛋白互作蛋白的篩選[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

4 潘溪;豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及ELISA檢測方法的初步建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

5 蔡青秀;豬流行性腹瀉病毒主要結(jié)構(gòu)基因遺傳變異分析及ELISA檢測方法的建立[D];中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;2015年

6 劉連增;豬流行性腹瀉病毒全長cDNA克隆及復(fù)制子的構(gòu)建[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 高杏丹;PEDV福建野毒株主要功能基因的分子遺傳學(xué)特征比較[D];福建師范大學(xué);2013年

8 杜季梅;仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查及卵黃抗體在PEDV防治中的應(yīng)用[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

9 孫振;豬流行性腹瀉病毒熒光定量PCR方法和間接ELISA方法的建立與初步應(yīng)用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 唐瑩;減毒沙門氏菌遞呈PEDV S/M雙基因核酸疫苗研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47對PEDV復(fù)制影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。