本文關鍵詞：梅花鹿感染犬新孢子蟲雙抗夾心Dot-ELISA檢測方法的建立及應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《吉林大學》 2015年

梅花鹿感染犬新孢子蟲雙抗夾心Dot-ELISA檢測方法的建立及應用

田來明  

【摘要】：犬新孢子蟲（Neospora caninum, N. caninum）于1984年在歐洲被首次發(fā)現，為細胞內寄生蟲。新孢子蟲的終末宿主為犬，中間宿主為奶牛、綿羊、山羊、牛、馬、鹿等動物；蟲體的寄生部位是宿主的中樞神經系統(tǒng)、肌肉、肝、腦及其他內臟組織；臨床上可引起奶牛等孕畜流產及新生幼畜神經系統(tǒng)疾病等，給畜牧業(yè)造成嚴重的經濟損失。然而目前尚無效果顯著的藥物來治療該病，所以靈敏特異的臨床診斷方法成為了防治該病的重點。 據報道新孢子蟲可感染特種經濟動物—鹿，對鹿的健康和相關產品造成影響，目前沒有針對鹿感染犬新孢子蟲的診斷方法。因此，本研究利用新孢子蟲MIC6蛋白制備單克隆抗體，建立檢測梅花鹿感染犬新孢子蟲的雙抗夾心Dot-ELISA診斷方法；從而為深入研究梅花鹿感染犬新孢子蟲防治奠定基礎。 1、新孢子蟲MIC6單克隆抗體的制備：本研究的免疫抗原為新孢子蟲的pGEX-MIC6重組蛋白，利用該抗原對BALB/c小鼠進行免疫，取其脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，經克隆篩選獲得兩株雜交瘤細胞株，分別命名為1A1和1H11，染色體數目分別為90條和94條，經亞類鑒定1A1為IgG1，1H11為IgG2b。先后采用辛酸－飽和硫酸銨法和親和層析法純化抗體，腹水效價測定結果發(fā)現1A1和1H11效價分別為5.12×104和1.024×105，濃度分別為0.974mg/mL和2.01mg/mL。特異性試驗發(fā)現這兩株單抗不僅能特異性識別新孢子蟲，還與弓形蟲無交叉反應。 2、新孢子蟲MIC6蛋白抗原定位：利用免疫熒光技術，通過共聚焦激光掃描熒光顯微鏡對新孢子蟲MIC6蛋白抗原進行了定位，發(fā)現該蛋白定位于新孢子蟲速殖子前端。 3、梅花鹿人工感染犬新孢子蟲的試驗：本研究利用人工感染試驗使梅花鹿感染犬新孢子蟲，觀察其臨床癥狀、病理組織變化并進行免疫組織化學檢測，結果發(fā)現接種新孢子蟲體后鹿出現體溫升高，精神沉郁，厭食；剖檢觀察發(fā)現肝臟淤血腫大，表面有白斑；肺臟有局灶性暗紅色病灶；腦膜淤血、水腫。對組織器官進行HE染色和免疫組織化學試驗后發(fā)現，肝細胞發(fā)生變性壞死；腎小球系膜細胞增生；心肌細胞顆粒變性等，腦組織內發(fā)現有包囊，但其它組織中未觀察到包囊樣結構。檢測接種新孢子蟲后鹿血清中循環(huán)抗原，結果發(fā)現循環(huán)抗原的量呈先上升后下降趨勢。 4、梅花鹿感染犬新孢子蟲雙抗夾心Dot-ELISA檢測方法的建立及應用：利用抗新孢子蟲MIC6單克隆抗體，建立了檢測梅花鹿感染犬新孢子蟲雙抗夾心Dot-ELISA的方法，，建立了其結果判定標準，經過一系列試驗測定確定最佳反應條件為： HRP標記抗體稀釋比例為1:100，包被抗體最適濃度為0.3μg/片，被檢血清最合適的稀釋比例為1:8。特異性、敏感性、重復性、靈敏度試驗結果表明建立的方法具有良好的特異性、敏感性、重復性和靈敏度。同時利用該方法和雙抗夾心ELISA方法對長春地區(qū)某鹿場鹿79份血清樣品同時進行檢測，結果表明陽性率均為15.2%（12/79）。從而為梅花鹿感染犬新孢子蟲的檢測提供了新方法。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.25
【目錄】：

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