【摘要】：病毒感染和宿主抗病毒是一個博弈的過程:許多病毒感染宿主后,病毒的病原相關分子模式被宿主的模式識別受體所識別,從而激活宿主I型干擾素(IFN)信號通路,導致數(shù)以百計的干擾素刺激基因(ISGs)轉錄,為機體提供抗病毒防御;與此同時,病毒也進化出多種高效的逃逸策略來抵抗宿主合成IFN、信號傳導以及ISGs的抗病毒功能。ISGs作為重要的抗病毒效應分子,其在宿主防御和清除外源病原感染方面發(fā)揮重要作用。因此,研究抗病毒ISGs對于控制和治療病毒感染具有重要意義。豬瘟(CSF)是一種急性、烈性傳染病,在多個國家流行,給我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。豬瘟病毒(CSFV)是CSF的病原,其屬于黃病毒科瘟病毒屬成員。CSFV感染宿主后,可激活I型IFN信號通路,產(chǎn)生抗病毒ISGs。與黃病毒科其它成員的抗病毒ISGs研究相比較,抗CSFV特異性ISGs研究報道很少,特別是ISGs抗CSFV感染的分子機制研究尚屬空白。研究抗CSFV ISGs不僅有助于深入了解宿主抗病毒機理,同時也為揭示CSFV逃避宿主抗病毒策略提供線索。因此,研究抗CSFV ISGs既具有理論意義又具有重大的應用價值。本研究中,我們構建了20種慢病毒介導的過表達豬源ISGs的PK-15細胞系。利用過表達細胞系結合表達螢火蟲熒光素酶的報告豬瘟病毒(rCSFV-Fluc)篩選抗CSFV的ISGs,成功地篩選到6個ISGs顯著地抑制rCSFV-Fluc復制,分別是GBP1、GBP2、CD47、ZNF313、OASL和OAS1。將篩選到的過表達GBP1、CD47、ZNF313和OASL細胞系感染親本病毒CSFV Shimen株,結果表明,過表達這些分子可以抑制親本病毒復制,說明這4個ISGs分子是抗CSFV的ISGs。我們優(yōu)先選取鳥苷酸結合蛋白1(GBP1)進行深入研究。研究結果表明,過表達GBP1抑制CSFV復制,相反利用針對GBP1的小干擾RNA沉默內(nèi)源性的GBP1可以促進CSFV復制。此外,GBP1發(fā)揮抗CSFV作用主要發(fā)生在病毒復制早期,及劑量依賴性的抑制CSFV內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)的翻譯效率。CSFV感染豬或PK-15細胞后,可以引起GBP1在轉錄水平上調(diào)表達。在GBP1抗CSFV分子機制方面,研究證實GBP1不能激活IFN-β和NF-κB信號通路,其抗CSFV是依賴于自身的GTPase活性。CSFV面對宿主GBP1的抗病毒效應,其利用自身合成的NS5A蛋白與GBP1相互作用,通過抑制GBP1的GTPase活性進而拮抗GBP1的抗CSFV活性。有趣的是,我們的研究還發(fā)現(xiàn),GBP1(K51A)突變體喪失了GTPase活性,且不能抑制CSFV復制。免疫共沉淀試驗和GST pulldown試驗結果表明,GBP1 N端的GTPase結構域和NS5A的C端功能區(qū)是GBP1-NS5A相互作用的關鍵區(qū)域�？傊�,本研究利用報告病毒并結合過表達細胞系的高通量篩選策略,獲得了6個抗CSFV ISGs候選分子。經(jīng)過系統(tǒng)的鑒定,證實GBP1為抗CSFV的ISG,并闡明了該分子發(fā)揮抗病毒作用依賴于其自身的GTPase活性,而CSFV則利用其NS5A蛋白與GBP1相互作用抑制GBP1的GTPase活性,進而拮抗GBP1的抗病毒功能。
[Abstract]:Viral infection and host versus virus are a game process: after many viruses infect the host, the pathogen-associated molecular patterns of the virus are recognized by the host's pattern recognition receptor, thus activating the host type I interferon (IFN) signaling pathway. It results in hundreds of interferon stimulating gene (ISGs) transcription, providing antiviral defense for the body; At the same time, the virus has evolved a variety of efficient escape strategies to resist the host synthesis of IFN, signal transduction and the antiviral function of ISGs. ISGs is an important antiviral effector. It plays an important role in host defense and elimination of exogenous pathogens infection. Therefore, the study of antiviral ISGs is of great significance in the control and treatment of viral infection. Swine fever (CSF) is an acute and acute infectious disease, which is prevalent in many countries and has caused huge economic losses to the pig industry in China and the world. Classical swine fever virus (CSFV) is the pathogen of CSF, which belongs to the family Flavovirus.After CSFV infects the host, it activates the type I IFN signaling pathway and produces anti-virus ISGs.. Compared with other members of the yellow virus family, there are few studies on anti-virus ISGs, especially on the molecular mechanism of ISGs anti-CSFV infection. The study of anti-CSFV ISGs not only helps to understand the mechanism of host anti-virus, but also provides clues for CSFV to escape from host anti-virus. Therefore, the study of anti-CSFV ISGs has both theoretical significance and great application value. In this study, we constructed 20 lentivirus-mediated PK-15 cell lines that overexpression porcine ISGs. Screening of ISGs, resistant to CSFV by overexpression Cell Line and expression of Fluorworm luciferase Reporter Swine Fever virus (rCSFV-Fluc) six ISGs significantly inhibited rCSFV-Fluc replication, GBP1,GBP2,CD47,ZNF313,OASL and OAS1., respectively. The selected overexpression GBP1,CD47,ZNF313 and OASL cell lines were infected with parental virus CSFV Shimen strain. The results showed that the overexpression of these molecules could inhibit the replication of parental virus, indicating that the four ISGs molecules were ISGs. resistant to CSFV. We preferentially selected guanylate binding protein 1 (GBP1) for further study. The results show that overexpression of GBP1 inhibits CSFV replication, whereas RNA silencing endogenous GBP1 against GBP1 can promote CSFV replication. In addition, the anti- CSFV effect of GBP1 mainly occurred in the early stage of viral replication, and in a dose-dependent manner inhibited the translation efficiency of (IRES), the ribosomal entry site of CSFV. CSFV infection with porcine or PK-15 cells could induce the up-regulation of GBP1 expression at the transcriptional level. In the aspect of the molecular mechanism of GBP1 anti-CSFV, it has been proved that GBP1 can not activate IFN- 尾 and NF- 魏 B signaling pathway, and its anti-CSFV is dependent on its GTPase activity. CSFV has antiviral effect on host GBP1, and it interacts with GBP1 by using self-synthesized NS5A protein. By inhibiting the GTPase activity of GBP1 and then antagonizing the CSFV activity of GBP1. Interestingly, our study also found that GBP1 (K51A) mutants lost GTPase activity and did not inhibit CSFV replication. The results of immunoprecipitation and GST pulldown tests showed that the N-terminal GTPase domain of GBP1 and the C-terminal functional region of NS5A were the key regions of GBP1-NS5A interaction. In conclusion, in this study, six candidate molecules against CSFV ISGs were obtained by using the high throughput screening strategy of report virus and overexpression cell lines. It was confirmed that GBP1 was an antiviral ISG, of CSFV and that its antiviral action depended on its own GTPase activity, while CSFV used its NS5A protein to interact with GBP1 to inhibit GTPase activity of GBP1, thus antagonizing the antiviral function of GBP1.
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28

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