發(fā)布時(shí)間：2018-11-17 11:31

【摘要】：雞球蟲病是由細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲——艾美耳屬球蟲(Eimeria)引起的全球性獸醫(yī)衛(wèi)生問題。雞球蟲病導(dǎo)致雞群體重增長緩慢,料肉比降低和高死亡率,給養(yǎng)殖戶收益和市場上的禽肉供給帶來了巨大損害。目前世界上得到普遍公認(rèn)的雞球蟲種有七個(gè),其中E.acervulina、E.nectrix、Emaxima和E.tenella最普發(fā)。雞艾美耳球蟲在雞腸道內(nèi)寄生的部位體現(xiàn)出高度的特異性,比較典型的有E.acervulina主要寄生于十二指腸,E.maxima主要寄生于空腸,E.tenella主要寄生于盲腸,而E.brunetti則主要寄生于直腸。已有研究指出E.tenella微線蛋白3 (EtMIC3)是決定E.tenella寄生于盲腸的關(guān)鍵分子,然而決定E.maxima寄生部位的關(guān)鍵分子尚未見報(bào)道。因此研究E.maxima與雞空腸上皮細(xì)胞之間互作的分子機(jī)制有利于更深入的掌握E.maxima入侵的分子機(jī)制也有助于制定防控雞球蟲感染的策略。本研究鑒定了雞空腸上皮細(xì)胞E.maxima子孢子結(jié)合蛋白,并選取四種E.maxima微線蛋白進(jìn)行克隆、表達(dá)并評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)力,旨在闡明決定E.maximE入侵部位特異性的關(guān)鍵分子,并為研發(fā)新型抗E.maxima疫苗篩選理想的候選抗原。1.巨型艾美耳球蟲子孢子空腸上皮細(xì)胞結(jié)合蛋白的鑒定本研究旨在鑒定E.maxima子孢子空腸上皮細(xì)胞結(jié)合蛋白并分析其蛋白功能。應(yīng)用免疫共沉淀方法收集E.maxima子孢子空腸上皮細(xì)胞結(jié)合蛋白,鳥槍測序法-液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(shotgunLC-MS/MS)對蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示共有35種unique peptide count ≥ 2的E.Emaxima子孢子蛋白被鑒定,其中包括入侵相關(guān)蛋白MIC2、MIC7和MIC3。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示該35種蛋白均被成功注釋,其中22種(62.86%)蛋白被預(yù)測有結(jié)合活性,15種(42.86%)蛋白被預(yù)測有催化活性。這些蛋白可能參與E.maxima入侵宿主細(xì)胞的過程以及宿主靶細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)過程。本篇研究結(jié)果為我們進(jìn)一步探明E.maxima和雞空腸上皮細(xì)胞之間的相互作用提供基礎(chǔ),同時(shí)也為更好的闡釋E.maxima致病的分子機(jī)理提供依據(jù)。2.巨型艾美耳球蟲微線蛋白3基因的克隆、表達(dá)及免疫保護(hù)性研究本章研究運(yùn)用快速擴(kuò)增 cDNA 末端(rapid-ampilification of cDNA ends,RACE)技術(shù)獲得巨型艾美耳球蟲微線蛋白3基因(EmMIC3)的完整ORF。分別從主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫兩方面評(píng)價(jià)重組MIC3蛋白(rEmMIC3)對E.maxima感染的免疫保護(hù)作用,并測定rEmMIC3免疫雞的血清特異性抗體、細(xì)胞因子及脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力的變化。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示rEmMIC3免疫組在空腸病變記分、OPG和相對增重方面均與各對照組的差異均顯著(P0.05),其ACI為186.02;被動(dòng)免疫試驗(yàn)結(jié)果顯示三個(gè)不同稀釋濃度的大鼠抗rEmMIC3血清免疫相比于各對照組均能夠顯著減輕空腸病變,減少卵囊排出并提高相對增重率(P0.05),且試驗(yàn)組的ACI均高于于183。血清特異性抗體檢測結(jié)果表明rEmMIC3免疫雞血清特異性抗體濃度在首免疫一周后得到顯著提高,并在整個(gè)試驗(yàn)期間試驗(yàn)組特異性抗體濃度均顯著高于對照組。血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示rEmMIC3免疫能夠顯著上調(diào)血清細(xì)胞因子IL-2與IL-4(P0.05)。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果表明rEmMIC3能夠顯著增強(qiáng)雞脾臟淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)(P0.05)。綜上結(jié)果表明EmMIC3基因免疫原性較好,能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,對E.maxima感染提供優(yōu)秀的免疫保護(hù)力,可作為理想的E.maxima疫苗候選抗原。3.巨型艾美耳球蟲微線蛋白2基因的克隆、表達(dá)及免疫保護(hù)性研究本章應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增第三章鑒定的EmMIC2基因(FR718971.1),構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-MIC2和真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-MIC2。動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)被應(yīng)用于評(píng)估rEmMIC2和pVAX1-MIC2對E.maxima感染的免疫保護(hù)力,同時(shí)檢測了rEmMIC2和pVAX1-MIC2免疫雞血清特異性抗體、細(xì)胞因子和脾臟淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示空腸病變記分、OPG和相對增重等指標(biāo)方面,rEmMIC2和pVAX1-MIC2組與各對照組差異均顯著(P0.05),rEmMIC2組和pVAX1-MIC2組的ACI均大于165。血清特異性抗體檢測結(jié)果表明rEmMIC2和pVAX1-MIC2均能在首次免疫一周后提高雞體血清特異性抗體濃度,在加強(qiáng)免疫一周后特異性抗體水平達(dá)到最大值,并且均顯著高于各對照組的特異性抗體水平(P0.05)。血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示rEmMIC2和pVAX 1-MIC2免疫均能引起雞體產(chǎn)生更高水平的IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ、TGF-β與IL-4,且與對照組差異顯著(P0.05)。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示rEmMIC2和pVAX1 -MIC2免疫雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力均顯著高于對照組(P0.05)。上述結(jié)果表明EmMIC2免疫能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,具有中等的免疫保護(hù)性,可作為理想的E.maxima疫苗候選抗原。4.巨型艾美耳球蟲微線蛋白7基因的克隆、表達(dá)及免疫保護(hù)性研究本章應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增第三章鑒定的EmMIC7基因(FR718975),構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-MIC7和真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-MIC7。應(yīng)用動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)rEmMIC7和pVAX1-MIC7對E.maxima感染的免疫保護(hù)力,同時(shí)也測定了 rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫雞的血清特異性抗體、細(xì)胞因子和脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示相比于對照組,rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫均能夠顯著減輕空腸病變記分、減少OPG并提高相對增重率(P0.05)。rEmMIC7和pVAX1-MIC7組的ACI均大于167。血清特異性抗體檢測結(jié)果表明rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫一周后提高雞體血清特異性抗體濃度,在加強(qiáng)免疫一周后特異性抗體濃度達(dá)到最大值,并且均顯著高于各對照組(P0.05)。血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示rEmMIC7和pVAXI-MIC7 免疫均能顯著上調(diào)雞體 IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ、TGF-β 與 IL-4 濃度(P0.05)。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力均得到顯著提高(P0.05)。綜上結(jié)果表明EmMIC7免疫能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,具有中等的免疫保護(hù)性,可作為理想的E.maxima疫苗候選抗原。5.巨型艾美耳球蟲頂膜抗原1基因的克隆、表達(dá)及免疫保護(hù)性研究本章應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增EmAMA1基因(FN813221.1),構(gòu)建了串聯(lián)EmAMA1基因功能域的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-EmAMA1FD和真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-EmAMA1FD。應(yīng)用動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD的免疫保護(hù)力同時(shí)也檢測了 rEmAMA1FD和pVAX1- EmAMA1FD免疫雞的血清特異性抗體、細(xì)胞因子和脾臟淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD免疫組在空腸病變記分、OPG和相對增重等方面均與對照組的差異均顯著(P0.05),rEmAMA1FD 免疫組的 ACI 為 176.68,pVAX1-EmAMA1FD免疫組的ACI為180.35。血清特異性抗體檢測結(jié)果表明rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD免疫均能在首次免疫一周后提高雞血清特異性抗體濃度,在整個(gè)采樣期間試驗(yàn)組特異性抗體濃度均顯著高于各對照組(P0.05)。血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD免疫能夠顯著提高血清細(xì)胞因子引起雞體產(chǎn)生顯著高水平的IL-2、TGF-β與IL-4 (P0.05)。CCK-8試驗(yàn)結(jié)果表明rEmAMA1FD能夠顯著增強(qiáng)雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)(P0.05)。綜上結(jié)果表明EmAMA1FD免疫原性較強(qiáng),能夠誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,對E.maxima感染具有較好的免疫保護(hù)性,可作為理想的E.maxima疫苗候選抗原。6.重組MIC蛋白與雞腸上皮細(xì)胞的結(jié)合能力本章旨在檢測已獲得的四種重組E.maxima微線蛋白與不同雞腸段的結(jié)合能力。取無球蟲雞不同的腸段(十二指腸、空腸、盲腸和直腸)制備冰凍切片,應(yīng)用免疫熒光方法檢測前述表達(dá)并純化的四種重組E.maxima微線蛋白——rEmMIC3、rEmMIC2、rEmMIC7和rEmAMA1FD與不同雞腸段的結(jié)合能力。試驗(yàn)結(jié)果顯示rEmMIC3只與雞空腸結(jié)合,與十二指腸、盲腸和直腸均不結(jié)合,而rEmMIC2、rEmMIC7和rEmAMA1FD與各腸段均不結(jié)合。該結(jié)果提示僅雞空腸上皮細(xì)胞上存在EmMIC3基因受體,EmMIC3可能是決定E.maxima侵入部位特異性的關(guān)鍵分子,在E.maxima入侵宿主靶細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2337625