油茶(Camellia oleifera Abel)是我國特有的木本食用油料樹種之一,廣泛分布于在我國南方山地丘陵地區(qū)。該樹種生長的土壤中有效磷含量很低,而磷是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素之一,土壤缺磷是限制油茶生長發(fā)育和產(chǎn)量的關(guān)鍵因子。油茶在進(jìn)化過程中形成了一系列復(fù)雜的適應(yīng)低磷的響應(yīng),包括根系形態(tài)和生理生化上的一些適應(yīng)性調(diào)整。因此,充分利用油茶資源的遺傳多樣性,通過篩選磷高效利用油茶品種,挖掘油茶磷高效利用相關(guān)的基因及其功能,并通過分子標(biāo)記輔助育種和基因工程育種來提高油茶磷利用效率是解決油茶林地土壤缺磷的有效途徑。本文以兩個磷利用效率存在顯著差異的油茶無性系扦插苗為試驗材料,研究了低磷脅迫下的生理生化響應(yīng),篩選出了評價油茶磷高效利用的相關(guān)指標(biāo);進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組分析和熒光定量PCR分析,篩選出了磷高效利用相關(guān)的基因。主要研究結(jié)果如下:1.低磷脅迫下兩個無性系生理生化指標(biāo)比較分析,篩選油茶磷高效利用評價的相關(guān)指標(biāo)。(1)在低磷脅迫下,兩個油茶無性系的苗高、生物量(根、莖、葉和全株)、根系參數(shù)(總根長、表面積和體積)和磷吸收效率(磷積累量)均顯著降低,而根冠比和磷利用效率顯著增高;長林166號的苗高、根系和整株的生物量、根系參數(shù)、根冠比和磷利用效率均顯著高于長林4號,說明長林166號相對長林4號為磷高效利用基因型無性系。(2)低磷脅迫下,兩個油茶無性系根系中的酸性磷酸酶、有機(jī)酸合成相關(guān)酶(CS、NAD-MDH和PEPEC酶)、抗氧化性保護(hù)酶(SOD、POD和CAT酶)活性均顯著上升;且兩個油茶無性系根系中的生長素(IAA)、赤霉素(GA)和脫落酸(ABA)均顯著上升而分裂素(ZR)顯著下降低;長林166號根系中酸性磷酸酶活性,有機(jī)酸相關(guān)酶活性、抗氧化性保護(hù)酶(SOD、POD)活性和內(nèi)源激素含量均比長林4號高。(3)低磷脅迫后,兩個油茶無性系葉片葉綠素、光合氣體交換參數(shù)(Pn、Tr、Gs和Ci)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、Y(II)、q L和ETR)均顯著降低,而葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Y(NPQ)、Y(NO)和qN)均升高。低磷脅迫下,長林166號的葉綠素、Pn、Tr、Gs、Ci、Fv/Fm、Y(II)、qL和ETR值均比長林4號高,而Y(NPQ)、Y(NO)和qN比長林4號低,說明長林166號受到低磷脅迫的傷害較長林4號輕,光合效率比長林4號高。(4)根據(jù)生理指標(biāo)的相關(guān)分析結(jié)果,篩選出根系干重、總生物量、根冠比作為大規(guī)模篩選磷高效油茶品種的關(guān)鍵指標(biāo);磷利用效率作為確認(rèn)的指標(biāo);光合氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)可作為輔助篩選指標(biāo),可用于油茶無性系耐低磷能力的早期鑒定。2.不同磷水平下兩個油茶無性系根系轉(zhuǎn)錄組分析。轉(zhuǎn)錄組測序獲得了614,364,144條clean reads,Q20均在97%以上。通過組裝共獲得了208,506個unigene,平均長度785bp,N50平均長度為1452bp。根據(jù)166LP-VS-166HP與166LP-VS-4LP的差異基因,篩選出磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因(Pht1,1、Pht1,2、Pht1,4、Pht1,9、pho1-1、Pho1-3)、酸性磷酸酶家族基因(PAP1、PAP2、PAP3、PAP18)、有機(jī)酸分泌相關(guān)基因(CS、NAD-MDH、PEPC和ALMT)、轉(zhuǎn)錄因子PHR2和根系調(diào)控相關(guān)基因PDR2一共16個基因,這些基因可能是長林166號的磷高效利用的相關(guān)基因。3.磷高效相關(guān)基因?qū)Φ土椎捻憫?yīng)以及在不同無性系不同磷水平下的表達(dá)分析。根據(jù)相關(guān)基因的表達(dá)分析并結(jié)合其在磷吸收和磷信號調(diào)控中的作用,篩選出PHR2、PDR2、CS、ALMT、Pht1,9、Pho1-3和PAP1基因可能是長林166號磷高效利用的關(guān)鍵基因。4.PHO1-3、ALMT、CS和PHR2基因的克隆和生物信息學(xué)分析。通過RT-PCR技術(shù),從油茶根系中分離出了磷轉(zhuǎn)運(yùn)子基因CoPHO1-3、鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因CoALMT、檸檬酸合成酶基因CoCS和轉(zhuǎn)錄因子CoPHR2。它們的CDS全長依次為2406bp、1761bp、1416bp和1419bp,分別編碼801AA、586AA、471AA和472AA。通過與來源于其他物種的基因的聚類分析,發(fā)現(xiàn)CoPHO1-3蛋白與芝麻、野生大豆和大豆的PHO1-3蛋白親緣關(guān)系較近。CoALMT、CoCS和CoPHR2蛋白與葡萄的親緣關(guān)系較近。5.CoCS和CoPHR2基因轉(zhuǎn)化擬南芥。通過Gateway技術(shù)構(gòu)建了CoCS和CoPHR2基因的植物表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌浸染花蕾法轉(zhuǎn)化擬南芥,經(jīng)潮霉素抗性篩選和PCR檢測,最終篩選獲得擬南芥cs突變體和野生型WT轉(zhuǎn)CoCS基因的陽性轉(zhuǎn)基因株系分別為6個和5個;擬南芥phr1突變體和野生型WT轉(zhuǎn)CoPHR2基因的陽性轉(zhuǎn)基因株系分別為8個和6個。
【學(xué)位授予單位】：中國林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S794.4

【參考文獻(xiàn)】

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

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2 李青松;大豆磷高效品種的篩選及磷高效生理機(jī)制的研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

本文編號：2174851