【摘要】：小穗育性是水稻高產(chǎn)的決定因素之一。高且穩(wěn)定的小穗結(jié)實(shí)率是水稻超高產(chǎn)雜交水稻的重要特征。水稻半不育突變體在作物育種、遺傳學(xué)、生殖生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究中提供了很好的材料,若能用穩(wěn)定的半不育突變體進(jìn)行研究,闡明半不育產(chǎn)生的分子機(jī)制,對(duì)克服生產(chǎn)中遇到的半不育問(wèn)題具有重要的借鑒意義。在開(kāi)花植物受精過(guò)程中,花粉管在雌蕊中生長(zhǎng)的過(guò)程就是其與雌蕊相互識(shí)別的過(guò)程,為了更好地理解花粉管和雌蕊的相互作用分子機(jī)制,需要識(shí)別和分離涉及此過(guò)程各個(gè)階段的基因,并對(duì)其功能進(jìn)行分析。作為進(jìn)行光合作用的主要器官,葉片對(duì)于種子植物的生長(zhǎng)發(fā)育十分重要。在水稻育種中,倒三葉葉片長(zhǎng)、窄、薄、直立且適當(dāng)卷曲是超高產(chǎn)雜交水稻的重要特征。其中,葉片適當(dāng)卷曲是突破產(chǎn)量瓶頸的關(guān)鍵,因此,克隆控制卷葉基因并明確其功能具有重大的生產(chǎn)意義。本研究對(duì)一個(gè)新的小穗半不育突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),在水稻受精過(guò)程中,OsCNGC13能夠促進(jìn)花粉管通道內(nèi)的細(xì)胞程序性死亡而促進(jìn)花粉管的生長(zhǎng),該結(jié)果為進(jìn)一步闡明水稻生殖發(fā)育的分子機(jī)制提供了新思路。此外,對(duì)一個(gè)新的水稻卷葉突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),OsZHD1在水稻形態(tài)建成尤其是泡狀細(xì)胞的形成和分布中起重要作用,過(guò)表達(dá)該基因會(huì)導(dǎo)致植株葉片卷曲,泡狀細(xì)胞數(shù)量增多且排列異常。本研究主要結(jié)果如下:1.ORF1突變是導(dǎo)致突變體結(jié)實(shí)率下降的主要原因。細(xì)胞學(xué)觀察表明,突變體花器官形態(tài)、花粉粒發(fā)育和體外萌發(fā)均正常;而在花粉管生長(zhǎng)和胚囊極核位置方面表現(xiàn)異常。遺傳分析表明,該突變由單顯性基因控制。通過(guò)精細(xì)定位將該基因定位在52-kb范圍內(nèi)。基因組測(cè)序結(jié)果表明突變體中有44-kb片段發(fā)生了倒置,兩邊的斷口分別在ORF1和ORF3的內(nèi)部,使得ORF1被截短形成NewORF1。3'RACE實(shí)驗(yàn)表明NewORF1與野生型ORF1相比,序列差異表現(xiàn)在C端。通過(guò)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)發(fā)現(xiàn),野生型中表達(dá)NewORF1會(huì)使植株結(jié)實(shí)率下降;在W109sss1-D中過(guò)表達(dá)ORF1,轉(zhuǎn)基因植株結(jié)實(shí)率有所提高;利用Crispr技術(shù)將野生型中ORF1進(jìn)行基因敲除,全部八個(gè)陽(yáng)性家系植株的結(jié)實(shí)率都有不同程度的下降。2. ORF1 編碼一個(gè)環(huán)核苷酸門(mén)控離子通道(cyclic nucleotide-gated channels,CNGCs)蛋白OsCNGC13,該蛋白主要通過(guò)調(diào)節(jié)花柱內(nèi)細(xì)胞程序性死亡而控制小穗育性。時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)OsCNGC13呈組成型表達(dá)模式,并在雌蕊中大量累積。水稻和煙草系統(tǒng)表明該蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜。電生理實(shí)驗(yàn)證明OsCNGC13是一個(gè)鈣離子通道蛋白。水稻中有3個(gè)鈣調(diào)蛋白且均能與OsCNGC13互作,但在水稻16個(gè)CNGC家族成員中并未發(fā)現(xiàn)能與OsCNGC13互作的同源蛋白。利用原子吸收能譜對(duì)開(kāi)花前后雌蕊中鈣離子相對(duì)含量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在9311花柱中鈣離子明顯積累,而在突變體中并無(wú)此種現(xiàn)象。此外,用阿新藍(lán)染料對(duì)成熟花柱進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)突變體較野生型著色較淺且范圍較小。在開(kāi)花后30分鐘時(shí),能觀察到9311花粉管通道中的死亡細(xì)胞,但是突變體中相應(yīng)部位的細(xì)胞依舊完整。開(kāi)花后兩小時(shí),能觀察到9311花粉管通道中存在大量細(xì)胞間隙,但是在突變體中只有少量細(xì)胞發(fā)生了消亡。3. OsZHHD1控制水稻葉片卷曲。對(duì)反卷葉突變體進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),突變體葉片中泡狀細(xì)胞增加且排列異常。遺傳數(shù)據(jù)和分子實(shí)驗(yàn)表明,T-DNA插入使鋅指同源異型盒轉(zhuǎn)錄因子OsZHD1過(guò)表達(dá),從而導(dǎo)致水稻葉片出現(xiàn)反卷。OsZHD1表現(xiàn)為組成型表達(dá)并在發(fā)育中的葉和穗子中積累。野生型中過(guò)表達(dá)OsZHHD1發(fā)現(xiàn)在所得到的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性家系中,均出現(xiàn)了反卷葉的表型。
[Abstract]:Spikelet fertility is one of the determinants of high yield in rice. High and stable spikelet setting rate is an important characteristic of super high yield hybrid rice. The molecular mechanism of Semisterility in flowering plants is of great significance for overcoming the problem of Semisterility in production. In the process of fertilization, the growth of pollen tube in pistil is the process of recognition between pollen tube and pistil. As the main organ of photosynthesis, leaf is very important for the growth and development of seed plants. In rice breeding, long, narrow, thin, erect and properly curled leaves are the important characteristics of Super-high-yielding hybrid rice. In this study, a new spikelet semi-sterile mutant was studied. OsCNGC13 could promote programmed cell death in the pollen tube pathway and promote the growth of pollen tube during rice fertilization. The results are as follows:1. In addition, studies on a new rice leaf roll mutant have shown that OsZHD1 plays an important role in rice morphogenesis, especially in the formation and distribution of vesicular cells. Overexpression of OsZHD1 results in leaf curl, increased number and abnormal alignment of vesicular cells. The main results were as follows: 1. ORF1 mutation was the main reason for the decrease of seed setting rate. Cytological observation showed that the mutant had normal floral organ morphology, pollen grain development and germination in vitro, but abnormal pollen tube growth and polar nucleus position of embryo sac. Genetic analysis showed that the mutation was controlled by a single dominant gene. The result of genome sequencing showed that 44-kb fragment was inverted in the mutant, and the fragments on both sides were located in ORF1 and ORF 3 respectively. The result of the ORF1 truncated to form NewORF1.3'RACE showed that the sequence difference between NewORF1 and ORF1 was C-terminal. Over-expression of ORF1 in W109sss1-D increased the seed setting rate of transgenic plants; knockout of ORF1 in wild-type plants by Crispr technology resulted in a decrease of seed setting rate in all eight positive families. 2. ORF1 encodes a cyclic nucleotide-gated ion channel (cyclic cn-n). Ucleotide-gated channels (CNGCs) protein OsCNGC13, which controls spikelet fertility by regulating programmed cell death in the style, was found to be a constitutive expression pattern and accumulated in the pistil. The rice and tobacco systems indicated that the subcellular localization of OsCNGC13 was in the cell membrane. GC13 is a calcium channel protein. There are three calmodulin in rice and all of them can interact with OsCNGC13, but no homologous protein can interact with OsCNGC13 in 16 members of the rice CNGC family. In addition, the mutant was found to be lighter and less extensive than the wild type. At 30 minutes after anthesis, dead cells in the pollen tube passage of 9311 were observed, but the corresponding parts of the mutant were still intact. A large number of intercellular spaces were observed in the 9311 pollen tube channel, but only a few cells died out in the mutant. 3. OsZHHD1 controlled rice leaf curl. Cytological observation of the anti-curling mutant showed that the number of vesicular cells in the mutant leaves increased and arranged abnormally. Overexpression of the homeobox transcription factor OsZHD1 results in leaf roll reversal in rice. OsZHD1 is constitutively expressed and accumulated in developing leaves and spikes. Overexpression of OsZHHD1 in wild type results in leaf roll reversal in all transgenic positive families.
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S511

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本文編號(hào)：2176453