本文選題：甜瓜果斑病 + Ⅲ型分泌系統(tǒng)��； 參考：《中國農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文

【摘要】：西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)能夠侵染甜瓜等作物引起果斑病(Bacterial Fruit Blotch,BFB),Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Three Secretion System, TTSS)在其侵染寄主的過程中發(fā)揮關鍵作用。如果TTSS功能受到抑制,A. citrulli的致病性會明顯減弱甚至完全喪失。本研究將TTSS作為藥劑作用靶點,構建了篩選TTSS抑制劑的報告載體、明確了A. citrulli MH21中TTSS的誘導條件,建立了TTSS抑制劑高通量篩選體系。完成了對12000個化合物篩選試驗,發(fā)現(xiàn)了對TTSS有抑制作用的丙二腈肟醚類化合物,并且對該類化合物開展了甜瓜果斑病溫室防效、hrp/hrc基因表達qRT-PCR檢測、構效關系分析等研究。將食酸菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應子Aave_3502 (Pseudomonas syringae中TTSS Effector蛋白HopAO1同源蛋白)的N端信號肽和β-內(nèi)酰胺酶基因翻譯融合構建報告載體,轉化A. citrulli MH21野生型及TTSS突變體。利用胞外p-內(nèi)酰胺酶水解頭孢硝噻吩導致的顏色變化來判斷TTSS是否正常發(fā)揮功能。采用上述報告體系,系統(tǒng)檢測了TTSS誘導培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基酸堿度、離子濃度等條件,最終確定pH5.8以及含有10 mM鎂離子的LB培養(yǎng)基能夠誘導西瓜食酸菌TTSS表達。在此基礎上,建立了以96孔細胞培養(yǎng)板為載體、TTSS效應物信號肽融合β-內(nèi)酰胺酶為報告的TTSS抑制劑高通量篩選體系。通過對12000個人工合成化合物的初篩,發(fā)現(xiàn)了463個可能有抑制TTSS活性的化合物,其中的丙二腈肟醚類化合物對TTSS的抑制作用明顯優(yōu)于其他化合物。構效分析結果表明,2個丙二腈肟醚取代基團位于苯環(huán)對位的化合物活性較高,用鹵素或者硝基替換其中一個丙二腈肟醚結構,能夠進一步提高化合物的抑制活性�；铙w試驗中,部分丙二腈肟醚類化合物對A. citrulli MH21在植物體上的侵染發(fā)病有明顯的抑制作用,化合物33962對甜瓜果斑病的防效達到80%以上。采用qRT-PCR技術對經(jīng)過丙二腈肟醚類化合物處理的菌株進行檢測,發(fā)現(xiàn)TTSS編碼基因簇hrp/hrc中的保守基因hrcU、hrcC、hrcJ,外泌裝置基因hrpE以及泌出物基因hopDl的表達量有明顯影響,部分基因的表達量減少80%以上。綜合各階段研究結果進行分析,丙二腈肟醚類化合物有很大可能性是一種新的TTSS抑制劑。本研究發(fā)現(xiàn)的丙二腈肟醚類TTSS抑制劑,可以通過對病原細菌關鍵致病系統(tǒng)的抑制作用發(fā)揮其防病效果。由于該類化合物與傳統(tǒng)細菌病害防治藥劑作用機制完全不同,因此對于病原細菌的抗藥性治理和病害防治具有積極意義。
[Abstract]:Watermelon acid bacteria (Acidovorax citrulli) can infect melon and other crops to cause fruit spot disease (Bacterial Fruit Blotch, BFB). Type III secretory system (Type Three Secretion System, TTSS) plays a key role in the process of infecting host. If the TTSS function is inhibited, the pathogenicity will be significantly weakened or even completely lost. In this study, TTSS was used as a target for drug action. A report carrier for screening TTSS inhibitors was constructed. The induction conditions for TTSS in A. citrulli MH21 were clarified. A high throughput screening system for TTSS inhibitors was established. The screening tests for 12000 compounds were completed. The two nitrile oxime ether compounds with inhibitory effects on TTSS were found and the combination of these compounds was found. The greenhouse effect of melon fruit spot disease, the hrp/hrc gene expression qRT-PCR detection and the structure-activity relationship analysis were carried out. The N terminal signal peptide and beta lactamase gene of the acid bacteria type III secretory system effector Aave_3502 (Pseudomonas syringae protein HopAO1 homologous protein) were translated and fused by the beta lactamase gene, and the A. citrull was converted to A. citrull. I MH21 wild type and TTSS mutant. Using extracellular p- lactamase hydrolysis of cefitine thiophene to determine the normal function of TTSS. Using the above-mentioned reporting system, the TTSS induced medium, culture temperature, medium pH, ion concentration and so on were systematically detected, and pH5.8 and L containing 10 mM magnesium ions were finally determined. B medium can induce the expression of watermelon acid eating bacteria TTSS. On this basis, a high throughput screening system for TTSS inhibitors was established with 96 pore cell culture plate as carrier and TTSS effector signal peptide fused beta lactamase. By screening of 12000 synthetic compounds, 463 compounds that might have inhibition of TTSS activity were developed. The inhibitory effect of C two nitrile oxime ether on TTSS is obviously better than that of other compounds. The results of structure-activity analysis show that the 2 C two nitrile oxime ether substituents are more active in the benzene ring counterpart compound, and the substitution of one of the one two nitrile oxime ether with halogen or nitro can further improve the inhibitory activity of the compound. In the experiment, some two nitrile oxime ether compounds have obvious inhibitory effect on the infection of A. citrulli MH21 on plant body, and the control effect of compound 33962 on melon fruit spot is more than 80%. QRT-PCR technique is used to detect the strains treated by propane oxime ether compounds, and the protection of TTSS coding gene cluster hrp/hrc is found. The expression of gene hrcU, hrcC, hrcJ, exocrine gene hrpE and secretory gene hopDl was significantly affected, and the expression of some genes was reduced by more than 80%. The comprehensive results of various stages of study were analyzed. The propane two nitrile oxime ether compounds were highly likely to be a new TTSS inhibitor. This study found the TTSS inhibition of the class of malonitrile oxime ether. The preparation can play its preventive effect by inhibiting the key pathogenic bacteria of pathogenic bacteria. Because the mechanism of this kind of compound is completely different from that of the traditional bacterial disease control agent, it is of positive significance to the resistance control and disease control of the pathogenic bacteria.
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S432.4

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本文編號：1962341