本文選題：豬瘟病毒 + 線粒體自噬�。� 參考：《華南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染引起豬的一種烈性傳染病,具有急性、熱性、高度接觸性等特點(diǎn),被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病。CSFV強(qiáng)毒株感染可導(dǎo)致典型CSF的發(fā)生,臨床上以出血綜合征與免疫抑制為主要特征。近年來由于中等毒力或弱毒CSFV的出現(xiàn),導(dǎo)致豬群中發(fā)生持續(xù)的隱性帶毒與免疫抑制等狀況,這給CSF的控制與凈化帶來了更大的困難與挑戰(zhàn)。當(dāng)CSFV感染豬時(shí),單核巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞雖然是主要的親嗜性細(xì)胞,但CSF發(fā)生中出現(xiàn)的免疫抑制主要是由于淋巴B細(xì)胞與T細(xì)胞的大量減少造成的。淋巴細(xì)胞的減少除了與體內(nèi)的細(xì)胞因子紊亂有關(guān)外,凋亡的觸發(fā)也起著重要作用。研究表明,CSFV可通過抑制宿主細(xì)胞干擾素的產(chǎn)生與細(xì)胞凋亡,實(shí)現(xiàn)對(duì)親嗜性細(xì)胞的持續(xù)感染與病毒的大量復(fù)制。近年來,有關(guān)CSFV與宿主細(xì)胞相互博弈的研究雖然在不斷深入,但有關(guān)CSF的發(fā)病機(jī)制與免疫功能紊亂機(jī)制仍不清楚。因此,開展CSF的致病機(jī)制,特別是CSFV免疫逃逸機(jī)制的研究,對(duì)CSF的防控具有十分重要的意義。自噬是細(xì)胞進(jìn)化中非常保守的一種防御機(jī)制,在病毒感染過程中具有十分重要的作用。最新研究表明,多種病毒都可通過誘導(dǎo)線粒體自噬對(duì)細(xì)胞內(nèi)損傷的線粒體進(jìn)行清除。另有研究表明,自噬對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)代謝也具有重要的調(diào)控作用。我們的前期研究也表明,CSFV感染不但可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生,而且可以利用自噬促進(jìn)CSFV的復(fù)制與病毒粒子的釋放。在此基礎(chǔ)上,本論文一方面通過對(duì)CSFV與細(xì)胞線粒體自噬相互關(guān)系的研究,揭示線粒體自噬對(duì)CSFV復(fù)制以及細(xì)胞凋亡的影響。另一方面還通過對(duì)CSFV感染豬脾臟組織內(nèi)自噬與凋亡相互關(guān)系的分析,揭示自噬在脾臟細(xì)胞死亡中發(fā)揮的作用。此外,本論文利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)CSFV感染的PK-15與3D4/2細(xì)胞代謝物的多參數(shù)動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行檢測(cè),分析了糖代謝、核苷酸代謝、氨基酸代謝與脂肪酸代謝在CSFV復(fù)制與天然免疫逃逸中的作用。CSFV誘導(dǎo)線粒體自噬抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究。病毒感染過程中可將其蛋白通過線粒體定位序列靶向錨定于細(xì)胞線粒體導(dǎo)致線粒體損傷,同時(shí)病毒可特異性的誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體自噬清除損傷的線粒體并恢復(fù)線粒體穩(wěn)態(tài)。為了揭示CSFV感染誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體自噬以及線粒體自噬在CSFV感染中的作用機(jī)制,我們選取CSFV易感的PK-15細(xì)胞與豬固有免疫細(xì)胞-肺泡巨噬細(xì)胞3D4/2作為CSFV感染模型。首先利用westonblot對(duì)細(xì)胞感染csfv后不同時(shí)間線粒體的數(shù)量進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,細(xì)胞感染csfv后36h線粒體的數(shù)量開始減少。為了確認(rèn)csfv感染誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體減少與自噬發(fā)生的相關(guān)性,我們分別應(yīng)用自噬抑制劑3-methlyadenine(3-ma)與溶酶體遞呈抑制劑bafilomycina1(bafa1)對(duì)csfv感染pk-15與3d4/2細(xì)胞的自噬發(fā)生與溶酶體遞呈過程進(jìn)行阻斷,然后利用westonblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量的變化。結(jié)果表明,3-ma與bafa1均可阻止csfv感染細(xì)胞的線粒體數(shù)量減少,這提示csfv感染促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬的發(fā)生。為了進(jìn)一步證實(shí)csfv感染誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體自噬的發(fā)生,我們利用透射電鏡技術(shù)對(duì)csfv感染pk-15與3d4/2細(xì)胞的線粒體形態(tài)變化進(jìn)行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),csfv感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量膜狀結(jié)構(gòu)包裹的線粒體,表明csfv感染可誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體自噬樣結(jié)構(gòu)的形成。為探討csfv感染誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體自噬發(fā)生的機(jī)制,我們又對(duì)csfv感染pk-15與3d4/2細(xì)胞的線粒體進(jìn)行了分離純化,再通過westonblot技術(shù)對(duì)純化線粒體的pink1與parkin蛋白分子富集程度進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,csfv感染促進(jìn)了細(xì)胞pink1與parkin分子的線粒體移位。為了確定csfv感染增強(qiáng)細(xì)胞parkin分子的泛素化連接酶活性作用,我們利用免疫沉淀與westonbot對(duì)csfv感染pk-15與3d4/2細(xì)胞內(nèi)parkin下游分子-mfn2蛋白的泛素化水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果證明,csfv感染誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mfn2蛋白減少與parkin分子對(duì)mfn2蛋白的泛素降解是密切相關(guān)的。在證明了csfv感染誘導(dǎo)細(xì)胞pink1-parkin通路激活的基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步驗(yàn)證parkin分子的線粒體移位與線粒體自噬的直接聯(lián)系,我們利用激光共聚焦技術(shù)對(duì)csfv感染的pk-15與3d4/2細(xì)胞的parkin、gfp-lc3、線粒體三者之間的共定位情況進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),csfv感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)parkin標(biāo)記的線粒體與自噬體發(fā)生融合。為了進(jìn)一步證明csfv感染誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體完全自噬的發(fā)生,我們利用mito-mrfp-gfp線粒體自噬雙熒光報(bào)告系統(tǒng)對(duì)csfv感染pk-15與3d4/2細(xì)胞線粒體的溶酶體遞呈情況進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,csfv感染導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體呈現(xiàn)更多rfp熒光,證明了csfv感染可引起溶酶體對(duì)線粒體的降解。另外,為了確認(rèn)csfv感染pk-15與3d4/2細(xì)胞線粒體自噬體與溶酶體的融合,我們利用激光共聚焦技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)gfp-lc3、線粒體、溶酶體三者的共定位情況進(jìn)行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),csfv感染細(xì)胞內(nèi)與gfp-lc3熒光斑點(diǎn)融合的線粒體同時(shí)可以與溶酶體發(fā)生融合,說明csfv感染誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體自噬溶酶體的產(chǎn)生。在證明了csfv感染誘導(dǎo)pk-15與3d4/2細(xì)胞線粒體完全自噬發(fā)生的基礎(chǔ)上,本論文進(jìn)一步研究了csfv感染細(xì)胞內(nèi)線粒體活動(dòng)的變化。我們利用共聚焦顯微鏡對(duì)csfv感染pk-15與3d4/2細(xì)胞的線粒體形態(tài)以及drp1分子的線粒體移位情況進(jìn)行觀察,證明了csfv感染可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體分裂的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步研究線粒體分裂與線粒體自噬對(duì)csfv復(fù)制的影響,我們通過rna干擾技術(shù)下調(diào)pk-15和3d4/2細(xì)胞drp1和parkin基因的功能,應(yīng)用westonblot、qpcr與間接免疫熒光技術(shù)對(duì)csfv的npro蛋白表達(dá)水平、病毒拷貝數(shù)與病毒滴度進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果證明,下調(diào)細(xì)胞drp1與parkin基因功能可顯著降低csfv的npro蛋白表達(dá)、病毒拷貝數(shù)與病毒滴度,表明csfv可利用感染誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體分裂與線粒體自噬促進(jìn)病毒復(fù)制。為了闡明csfv感染誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體分裂與線粒體自噬促進(jìn)病毒復(fù)制的機(jī)制,我們對(duì)drp1與parkin基因功能下調(diào)的csfv感染pk-15和3d4/2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和parp的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),并應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,抑制csfv感染細(xì)胞的線粒體分裂與線粒體自噬可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。csfv感染導(dǎo)致豬脾臟t區(qū)部分細(xì)胞自噬性死亡。脾臟作為機(jī)體重要的外周免疫器官,有多種類群的巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞,并且是csfv體內(nèi)復(fù)制的重要場(chǎng)所。據(jù)此,本研究選取豬的脾臟作為靶器官對(duì)csfv體內(nèi)感染過程中病毒、自噬與凋亡的相互關(guān)系進(jìn)行研究。首先我們應(yīng)用免疫組化技術(shù)對(duì)脾臟組織中csfv的e2蛋白染色檢測(cè)csfv對(duì)脾臟細(xì)胞的感染情況。結(jié)果顯示,csfv感染豬的脾臟內(nèi)大部分細(xì)胞呈現(xiàn)陽(yáng)性。為研究csf發(fā)生過程中脾臟組織自噬水平的變化,我們利用westonblot對(duì)脾臟組織細(xì)胞lc3-ii與sqstm1/p62的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),csfv感染豬脾臟組織的lc3-i向lc3-ii的轉(zhuǎn)化與sqstm1/p62的降解增強(qiáng),提示csfv感染導(dǎo)致豬脾臟組織自噬水平增加。同時(shí),我們還通過westonblot對(duì)脾臟組織自噬相關(guān)蛋白atg5與becn1的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,csfv感染可促進(jìn)脾臟組織atg5與becn1的表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了csfv感染引起脾臟組織自噬途徑的活化。為了檢測(cè)csfv感染誘導(dǎo)脾臟組織中自噬陽(yáng)性細(xì)胞的分布情況,我們應(yīng)用免疫組化方法對(duì)脾臟組織的lc3-ii分子陽(yáng)性反應(yīng)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,csfv感染豬脾臟組織中的自噬陽(yáng)性細(xì)胞主要集中于脾小體周圍。在此基礎(chǔ)上,我們又通過流氏細(xì)胞術(shù)對(duì)csfv感染豬脾臟組織中的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)csfv感染可顯著促進(jìn)脾臟組織的細(xì)胞凋亡。為了再次確認(rèn)csfv感染與脾臟細(xì)胞凋亡的關(guān)系,我們對(duì)csfv感染豬脾臟組織的凋亡標(biāo)志性蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,csfv感染引起豬脾臟組織活化形式的caspase-8、caspase-9、caspase-3和parp的表達(dá)增加,提示csfv感染導(dǎo)致豬脾臟組織凋亡信號(hào)活化。為了解csfv感染誘導(dǎo)的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞在脾臟組織的分布情況,我們應(yīng)用tunel標(biāo)記法對(duì)csfv感染豬脾臟內(nèi)的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,csfv感染可導(dǎo)致脾臟內(nèi)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞同樣分布在脾小體周圍,提示csfv感染豬脾臟組織內(nèi)凋亡與自噬之間的密切關(guān)系。為了進(jìn)一步研究csfv感染豬脾臟組織內(nèi)自噬與凋亡的相互關(guān)系,我們應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)對(duì)csfv感染豬脾臟組織細(xì)胞lc3-ii與tunel的共定位情況進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,csfv感染導(dǎo)致豬脾臟組織內(nèi)部分lc3-ii陽(yáng)性細(xì)胞(約40%)同時(shí)呈現(xiàn)tunel陽(yáng)性,并且這些雙陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在脾小體周圍。以上結(jié)果提示,自噬在csf發(fā)生中可能導(dǎo)致脾臟組織細(xì)胞的死亡,并介導(dǎo)t區(qū)淋巴細(xì)胞的減少。為了闡明csfv感染脾臟組織內(nèi)自噬、凋亡與病毒感染的關(guān)系,我們利用激光共聚焦技術(shù)對(duì)csfve2蛋白與lc3-ii分子、csfve2蛋白與tunel分子的共定位情況分別進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,csfv感染豬脾臟組織內(nèi)大部分的自噬陽(yáng)性細(xì)胞被csfv感染,與之不同的是凋亡細(xì)胞很少被csfv感染。值得注意的是,少部分未被csfv感染的細(xì)胞也呈現(xiàn)自噬陽(yáng)性。csfv感染的代謝組學(xué)研究。病毒感染可引起細(xì)胞內(nèi)某些代謝物質(zhì)的變化并與疾病的發(fā)生有關(guān),但有關(guān)csfv感染與細(xì)胞內(nèi)的代謝物質(zhì)變化關(guān)系的研究未見報(bào)道。本論文利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)csfv感染的pk-15與3d4/2細(xì)胞代謝物質(zhì)變化情況進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果顯示,在糖代謝方面,csfv感染導(dǎo)致pk-15細(xì)胞糖酵解途徑中的葡萄糖、果糖-6-磷酸、甘油醛-3-磷酸含量減少,也導(dǎo)致3d4/2細(xì)胞糖酵解途徑中甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸含量減少,表明csfv感染導(dǎo)致細(xì)胞糖酵解途徑中代謝物的利用率增加,提示csfv感染促進(jìn)細(xì)胞糖酵解的發(fā)生。同時(shí),csfv感染促進(jìn)pk-15細(xì)胞三羧酸循環(huán)中檸檬酸、異檸檬酸、α-酮戊二酸的產(chǎn)生,卻抑制3d4/2細(xì)胞這3種物質(zhì)的產(chǎn)生,提示csfv感染激活pk-15細(xì)胞三羧酸循環(huán)為病毒復(fù)制提供充足的能量,相反csfv感染可能通過抑制3d4/2細(xì)胞三羧酸循環(huán)限制細(xì)胞免疫功能發(fā)揮需要的能量。在核苷酸代謝方面,csfv感染pk-15細(xì)胞5-磷酸核酮糖含量減少,表明csfv感染導(dǎo)致PK-15細(xì)胞磷酸戊糖途徑中代謝物的利用率增加,提示CSFV感染激活PK-15細(xì)胞磷酸戊糖途徑并促進(jìn)病毒RNA合成需要的戊糖產(chǎn)生。CSFV感染PK-15細(xì)胞葡萄糖醛酸、木糖醇、木酮糖、阿糖醇的含量均減少,表明CSFV感染導(dǎo)致PK-15細(xì)胞葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化途徑中代謝物的利用率增加,提示CSFV感染同樣可激活PK-15細(xì)胞葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化途徑并促進(jìn)戊糖產(chǎn)生。同時(shí),CSFV感染PK-15細(xì)胞肌苷、肌苷酸、鳥嘌呤含量均減少,提示CSFV感染PK-15細(xì)胞病毒RNA合成活動(dòng)對(duì)堿基的消耗增加。另外,CSFV感染3D4/2細(xì)胞5-單磷酸尿嘧啶的含量減少,也提示CSFV感染3D4/2細(xì)胞內(nèi)病毒RNA合成活動(dòng)對(duì)堿基的消耗增加。在氨基酸代謝方面,CSFV感染抑制PK-15細(xì)胞丙氨酸、天冬氨酸與谷氨酸降解途徑、丙氨酸與天冬氨酸代謝途徑、甘氨酸、絲氨酸與蘇氨酸代謝途徑、纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸降解途徑,提示CSFV感染抑制PK-15細(xì)胞的蛋白合成。與其相反的是CSFV感染激活3D4/2細(xì)胞纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸降解途徑、丙氨酸、天冬氨酸與谷氨酸降解途徑、β-丙氨酸代謝途徑、�；撬崤c亞牛磺酸代謝途徑,提示CSFV感染促進(jìn)3D4/2細(xì)胞的蛋白合成。在脂肪酸代謝方面,CSFV感染PK-15細(xì)胞的棕櫚烯酸、棕櫚油酸含量減少,CSFV感染3D4/2細(xì)胞的棕櫚油酸含量增加,提示CSFV感染可導(dǎo)致細(xì)胞脂代謝的紊亂,但這種影響因細(xì)胞種類而異。
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【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28

【參考文獻(xiàn)】

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2 王家富,張楚瑜,王寧,傅烈振,黃茜華;豬瘟病毒石門株與兔化弱毒株E0糖蛋白基因的克隆及序列分析[J];微生物學(xué)報(bào);2000年01期

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本文編號(hào)：1961515