本文選題：長牡蠣 + 免疫系統(tǒng)��； 參考：《中國科學院研究生院(海洋研究所)》2016年博士論文

【摘要】：長牡蠣是世界范圍內(nèi)重要的海水養(yǎng)殖品種,也是軟體動物門,冠輪動物超門最具代表性的物種之一。然而近年來長牡蠣大規(guī)模死亡事件頻發(fā),特別是夏季苗種繁育時期稚貝的大量死亡,逐漸成為制約養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的一個限制性因素。本論文主要采用分子免疫學等技術(shù),分析了長牡蠣幼蟲在早期個體發(fā)育過程中的免疫防御能力,探討了造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在個體發(fā)育過程中的表達模式,并據(jù)此對長牡蠣發(fā)育過程中的造血作用進行了初步分析。研究結(jié)果進一步深化了無脊椎動物免疫系統(tǒng)發(fā)生和發(fā)育的研究,同時對貝類病害防控具有重要的指導意義。一、長牡蠣早期發(fā)育過程中免疫能力的檢測在早期D形幼蟲(17 hpf)中觀察到吞噬現(xiàn)象發(fā)生于面盤區(qū)域。此外,模式識別分子(integrinβ-1、caspase-3和C-type lectin 3)和免疫效應分子(IL17-5)的蛋白定位在面盤和消化腺區(qū)域,推測它們?yōu)槊庖呦到y(tǒng)發(fā)生的潛在位點。孵化期(9 hpf)為胚胎期和浮游期之間的過渡階段�？寡趸�(EC-SOD和CAT)和溶菌酶的活性,以及12個候選免疫因子的m RNA表達水平在孵化期處于發(fā)育過程中的最低水平。隨后在擔輪幼蟲期(15 hpf),3種酶的活性和7個候選免疫因子的m RNA表達量均開始上升。個體發(fā)育至D形幼蟲期(50 hpf),6個候選免疫因子的m RNA表達水平出現(xiàn)上升趨勢,殼頂幼蟲期(120 hpf),12個候選免疫因子的m RNA表達水平均出現(xiàn)穩(wěn)定的上升趨勢。燦爛弧菌刺激后,D形幼蟲中12個候選免疫因子的m RNA表達水平均顯著上調(diào)。上述結(jié)果表明幼蟲在孵化期時免疫能力相對較低,當發(fā)育至擔輪和D形幼蟲期,免疫系統(tǒng)開始發(fā)生發(fā)育,在病原菌的刺激下,免疫系統(tǒng)能夠被進一步激活。殼頂時期的幼蟲已經(jīng)具備較為完善的免疫系統(tǒng),能夠?qū)ν饨绱碳ぎa(chǎn)生有效的免疫應答。二、長牡蠣Cg-SCL基因的鑒定與功能分析克隆獲得長牡蠣造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Cg-SCL基因的c DNA序列,發(fā)現(xiàn)其含有一個保守的b HLH結(jié)構(gòu)域,并與脊椎動物及海膽中的同源SCL基因具有較高的相似性。Cg-SCL在牡蠣成體血細胞、鰓和外套膜組織中有較高的m RNA和蛋白表達水平。在長牡蠣早期個體發(fā)育過程中,Cg-SCL的m RNA表達水平從受精后緩慢上升,擔輪幼蟲早期(10 hpf)達到峰值,然后下降,直至個體發(fā)育至殼頂幼蟲期(120 hpf)。整體免疫熒光定位顯示Cg-SCL最先出現(xiàn)在囊胚期(4 hpf),呈現(xiàn)為近似對稱性的兩點,并且這一表達模式持續(xù)到原腸胚期(8 hpf),至擔輪幼蟲期Cg-SCL分布于背部區(qū)域并呈現(xiàn)為清晰的環(huán)形結(jié)構(gòu),D形幼蟲期,Cg-SCL蛋白在背部區(qū)域特化為兩個竇穴狀結(jié)構(gòu),同時以纖維狀貫穿整個幼蟲體內(nèi)。燦爛弧菌刺激后,D形幼蟲和殼頂幼蟲中Cg-SCL m RNA表達水平均出現(xiàn)顯著上調(diào)。在成體長牡蠣中,Cg-SCL的干擾會引起血細胞特異性基因(Integrin和Ec SOD)和造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(GATA3,C-Myb和c-kit)的顯著下調(diào)。上述結(jié)果說明Cg-SCL可以作為長牡蠣造血作用的標記分子,從其表達模式推測長牡蠣中造血作用類似于果蠅,存在胚胎和幼蟲兩次造血過程。胚胎造血發(fā)生于囊胚時期,幼蟲造血則發(fā)生于擔輪幼蟲時期,Cg-SCL可能在兩次造血過程中均發(fā)揮重要的作用,可以作為長牡蠣造血作用的潛在標記分子。三、長牡蠣Cg-Runt基因的鑒定及其時空表達模式克隆獲得長牡蠣造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Cg-Runt基因的c DNA序列,生物信息學分析發(fā)現(xiàn)它含有一個保守的Runt結(jié)構(gòu)域,同源于Runx家族分子中的Runx1基因。在血細胞、鰓和外套膜組織中檢測到較高的Cg-Runt m RNA和蛋白表達水平。在長牡蠣早期個體發(fā)育過程中,Cg-Runt在受精卵和胚胎期均有表達,且在擔輪幼蟲早期(10 hpf)達到表達峰值,但進入D形幼蟲期后,Cg-Runt m RNA表達水平顯著降低。整體免疫熒光定位顯示Cg-Runt蛋白在囊胚期(4 hpf)不規(guī)律地分布于整個胚胎,原腸胚期(8 hpf)分布于植物極,在擔輪幼蟲期(15 hpf)則分布于背部區(qū)域并呈現(xiàn)清晰的環(huán)形結(jié)構(gòu),在D形幼蟲早期(22 hpf),Cg-Runt蛋白在消化腺區(qū)域特化為竇穴狀結(jié)構(gòu),D形幼蟲期(50 hpf)以后蛋白信號呈纖維狀貫穿整個幼蟲體內(nèi),并且在殼頂幼蟲(120 hpf)期,信號更加強烈。研究結(jié)果表明Cg-Runt參與幼蟲造血過程,此外還可能在個體發(fā)育早期和幼蟲后期參與細胞分化和組織形成。四、長牡蠣Cg-GATA-2/3基因的鑒定與功能分析克隆獲得長牡蠣造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Cg-GATA-2/3基因的c DNA序列,生物信息學分析發(fā)現(xiàn)它含有兩個串聯(lián)重復的Zn F_GATA鋅指結(jié)構(gòu)域,與脊椎動物中的GATA-2和GATA-3,以及海洋動物中的同源GATA基因聚為一個大的類群。在血細胞、鰓和外套膜組織中檢測到較高Cg-GATA-2/3的m RNA和蛋白表達水平。整體免疫熒光定位顯示Cg-GATA-2/3蛋白在囊胚(4 hpf)和原腸胚期(8 hpf)不規(guī)律地分布于整個胚胎。隨著胚胎不斷發(fā)育在擔輪幼蟲期(15 hpf)遷移至背部區(qū)域并呈現(xiàn)為清晰的環(huán)形結(jié)構(gòu),在D形幼蟲早期(22 hpf)在背部區(qū)域特化為兩個竇穴狀結(jié)構(gòu),并持續(xù)到D形幼蟲中期。隨著個體發(fā)育為殼頂幼蟲(120 hpf),Cg-GATA-2/3蛋白的表達增多,集中分布于背部區(qū)域及面盤處。在成體長牡蠣中,Cg-GATA-2/3的干擾引起血細胞特異性基因Ec SOD和造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子C-Myb的顯著下調(diào),同時導致循環(huán)血細胞和鰓組織中的新生細胞數(shù)目顯著減少。以上研究結(jié)果表明Cg-GATA-2/3參與了胚胎和幼蟲兩次造血,對長牡蠣血細胞的生成具有重要的調(diào)控作用,可能主要通過調(diào)控Cg-SCL而間接參與胚胎造血,并協(xié)同Cg-SCL、Cg-Runt共同調(diào)控幼蟲造血。綜上所述,在長牡蠣的早期個體發(fā)育過程中,母源免疫物質(zhì)在胚胎早期為個體提供重要的免疫保護作用。個體免疫系統(tǒng)在擔輪幼蟲期開始發(fā)生發(fā)育,胚胎造血和幼蟲造血相繼發(fā)生在囊胚期和擔輪幼蟲期,其中轉(zhuǎn)錄因子Cg-SCL和Cg-GATA-2/3可能參與胚胎造血,Cg-SCL、Cg-Runt和Cg-GATA-2/3共同參與幼蟲造血作用;隨著幼蟲的發(fā)育,D形幼蟲的血細胞開始具有吞噬能力,免疫系統(tǒng)在殼頂幼蟲時期基本發(fā)育完善。
[Abstract]:In this paper , the expression patterns of human immune system in the early ontogeny of oyster larvae were studied by molecular immunology methods . and then declined until ontogeny reached the shell larval stage ( 120 hpf ) . The expression of Cg - Runt protein in the dorsal region is similar to that of Drosophila . In the early ontogeny of the long oyster , Cg - SCL may play an important role in the development of the long oyster . The Cg - Runt protein is distributed in the back region and presents a clear loop structure . The results showed that Cg - GATA - 2 / 3 was involved in the development of cell differentiation and tissue formation in the early and late stages of ontogeny .
【學位授予單位】：中國科學院研究生院(海洋研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：1958761