本文選題：柔嫩艾美耳球蟲(chóng)　切入點(diǎn)：鴉膽子　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：雞球蟲(chóng)病是雞常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)病,危害嚴(yán)重,每年對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前該病防治工作的開(kāi)展主要依靠藥物,但是隨著蟲(chóng)株耐藥性的產(chǎn)生,部分抗球蟲(chóng)藥物的效果大大降低甚至完全失效,因此發(fā)現(xiàn)新的藥物刻不容緩。藥用植物鴉膽子具有抗癌、抗阿米巴原蟲(chóng)、抗巴貝斯蟲(chóng)和抗瘧疾等多種功效,但其抗球蟲(chóng)活性仍有待研究。本研究通過(guò)人工感染雞球蟲(chóng)病模型評(píng)價(jià)鴉膽子提取物的體內(nèi)治療效果,利用熒光定量PCR技術(shù)在體外檢測(cè)鴉膽子提取物對(duì)球蟲(chóng)增殖的影響,并運(yùn)用電子顯微鏡觀察鴉膽子處理對(duì)卵囊或子孢子形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的改變,初步探索鴉膽子提取物的抗球蟲(chóng)作用機(jī)制。一、鴉膽子提取物制備及化學(xué)成分鑒定為制備實(shí)驗(yàn)所需的鴉膽子提取物,本試驗(yàn)運(yùn)用薄層色譜法對(duì)藥用植物進(jìn)行理化鑒定,通過(guò)乙醇回流法結(jié)合萃取方法制備鴉膽子提取物,并采用氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對(duì)其中的提取物鴉膽子油進(jìn)行了化學(xué)成分分析。形態(tài)學(xué)觀察及理化鑒定結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)材料為苦木科植物Brucea javanica(L.)Merr.成熟干燥的果實(shí)。實(shí)驗(yàn)制備了三種鴉膽子提取物,分別為石油醚提取物(Brucea javanica petroleum ether extract,BJ-PE)、乙醇提取物(Brucea javanica ethonal extract,BJ-EE)和水提物(Brucea javanica water extract,BJ-WE),GC-MS 分析結(jié)果表明鴉膽子油(即石油醚提取物)主要包含油酸等長(zhǎng)鏈的脂肪酸、脂肪醇類化合物以及少量芳香族揮發(fā)性成分。二、鴉膽子醇提物對(duì)雞球蟲(chóng)病的治療作用研究為明確鴉膽子提取物對(duì)雞球蟲(chóng)病的治療作用,實(shí)驗(yàn)一將雞分為5組:鴉膽子酵提物實(shí)驗(yàn)組(2.5g及5g生藥每千克飼料)、常山酮陽(yáng)性對(duì)照組、感染不給藥組和不感染不給藥組,每組10只雞,攻蟲(chóng)后檢測(cè)雞便血、糞便卵囊數(shù)量和組織病變程度。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組雞只的血便排出量和病變計(jì)分顯著降低(P0.05),但體重變化不顯著,且抗球蟲(chóng)指數(shù)最高僅為131,顯示輕度抗球蟲(chóng)效果。基于上述結(jié)果設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)二,增設(shè)較高劑量的鴉膽子酵提物組(10 g生藥每千克飼料),每組10只雞,檢測(cè)指標(biāo)同上。結(jié)果顯示增設(shè)的高劑量給藥組抗球蟲(chóng)指數(shù)最高可達(dá)146,具有中等強(qiáng)度的抗球蟲(chóng)效果。在實(shí)驗(yàn)二的基礎(chǔ)上,將實(shí)驗(yàn)三每組雞數(shù)量擴(kuò)大至20只,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果進(jìn)一步顯示,鴉膽子醇提物能有效減少雞血便的產(chǎn)生,降低卵囊排出量和盲腸中第二代裂殖體的數(shù)量,減輕盲腸病變程度,且對(duì)病雞體重增重?zé)o顯著影響;低、中、高劑量下抗球蟲(chóng)指數(shù)分別為154、161和155,達(dá)到了中等或良好的抗球蟲(chóng)效果。綜上,本試驗(yàn)表明鴉膽子醇提物具有顯著的抗雞球蟲(chóng)作用,可作為抗雞球蟲(chóng)病的候選藥物作進(jìn)一步研究。三、鴉膽子醇提物與鴉膽子素-D體外抗球蟲(chóng)活性研究為研究鴉膽子醇提物(BJ-EE)和鴉膽子特征性化合物鴉膽子素-D(Bruceine-D)的體外抗球蟲(chóng)活性,本試驗(yàn)利用MDBK細(xì)胞系建立柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的體外培養(yǎng)體系,采用MTT法測(cè)定BJ-EE和Bruceine-D對(duì)MDBK細(xì)胞的毒性,并基于上述試驗(yàn)結(jié)果明確了體外抗球蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)采用的藥物濃度分別為BJ-EE(2、1、0.5、0.25 和 0.125 μg/ml)、Bruceine-D(0.8、0.4、0.2、0.1 和 0.05 μg/ml),藥物作用時(shí)間分別為24 h、48 h和65 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,BJ-EE(2 μg/ml)和Bruceine-D(0.8 μg/ml)作用于細(xì)胞65h時(shí),細(xì)胞存活率在90%以上;與對(duì)照組相比,BJ-EE實(shí)驗(yàn)組中球蟲(chóng)DNA增殖量顯著降低,Bruceine-D除48 h、0.05 μg/ml實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)出了顯著差異,即具有抑制球蟲(chóng)增殖的作用;且球蟲(chóng)DNA增殖量在48 h和65 h時(shí)呈現(xiàn)藥物劑量依賴性,即藥物濃度越高則球蟲(chóng)的增殖量越低。綜上所述,BJ-EE和Bruceine-D在體外具有良好的抗球蟲(chóng)活性。四、鴉膽子提取物抗雞球蟲(chóng)病作用機(jī)制初步探索為明確鴉膽子提取物治療雞球蟲(chóng)病的作用機(jī)制,本研究使用不同濃度的石油醚提取物(BJ-PE)、乙醇提取物(BJ-EE)、水提物(BJ-WE)和Bruceine-D孵育處理未孢子化卵囊,并利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察作用后球蟲(chóng)子孢子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變。觀察可見(jiàn)乙醇提取物、水提取物和Bruceine-D均表現(xiàn)出抑制卵囊孢子化的作用;乙醇提取物和Bruceine-D處理后的子孢子呈現(xiàn)皺縮、變圓、變短、細(xì)胞輪廓模糊、細(xì)胞膜破裂的現(xiàn)象,且胞內(nèi)細(xì)胞器排列混亂,細(xì)胞結(jié)構(gòu)扭曲,呈現(xiàn)病態(tài)的啞鈴型。該結(jié)果表明鴉膽子對(duì)球蟲(chóng)卵囊孢子化具有輕微抑制作用,并在子孢子階段具有比較顯著的殺傷作用。因此,鴉膽子提取物抗球蟲(chóng)作用可能集中于子孢子階段。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)制備了鴉膽子石油醚提取物(油)、乙醇提取物和水提物,其中鴉膽子油主要含有油酸等脂肪酸類或脂肪醇類化合物;鴉膽子提取物具有抗雞球蟲(chóng)病的作用,抗球蟲(chóng)效果可達(dá)中等或良好;鴉膽子醇提物和Bruceine-D對(duì)體外培養(yǎng)球蟲(chóng)的DNA增殖有抑制作用;提取物對(duì)球蟲(chóng)子孢子階段具有明顯殺傷作用,但具體作用機(jī)理還需深入研究。該研究為抗球蟲(chóng)藥物的研發(fā)提供了新的方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.31

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本文編號(hào)：1695763