本文關(guān)鍵詞：豬肺炎支原體誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞基因差異表達(dá)譜研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

豬肺炎支原體誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞基因差異表達(dá)譜研究

王貴平  

【摘要】：豬支原體肺炎(MPS),是一種由豬肺炎支原體(Mhp)引起的豬慢性呼吸道病。MPS在世界范圍內(nèi)流行,在我國(guó)也長(zhǎng)期存在,嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。MPS逐漸被國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者所重視,對(duì)其研究的相關(guān)報(bào)道也較多,這些報(bào)道多集中在疫苗開發(fā)、病原學(xué)、藥物及診斷方面。MPS典型病理變化包括支氣管周圍炎、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增生、肺肉變和間質(zhì)性肺炎等；典型臨床癥狀包括喘氣、消瘦及惡病質(zhì)等。MPS典型病理變化和臨床癥狀發(fā)生機(jī)理、相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及相關(guān)細(xì)胞因子在疾病發(fā)生過程中的作用較少見到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)將從下列兩方面進(jìn)行研究。1、長(zhǎng)沙市及周邊地區(qū)MPS病原流行病學(xué)調(diào)查。從長(zhǎng)沙市及周邊地區(qū)采集了1260份豬樣品：鼻拭子45份,氣管拭子81份,支氣管肺泡灌洗液469份,豬肺625份和血液40份。對(duì)采集的樣品用PCR和序列分析的方法進(jìn)行了豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)和豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis, Mhr)檢測(cè)；對(duì)Mhr進(jìn)行了分離并初步鑒定。結(jié)果表明,Mhp和Mhr在長(zhǎng)沙市及周邊地區(qū)豬群中,最佳待檢樣品是：冬季收集的屠宰豬支氣管肺泡灌洗液(Mhp)和豬鼻拭子(Mhr)。本研究結(jié)果為長(zhǎng)沙市及周邊地區(qū)MPS防制及Mhp和Mhr檢測(cè)提供了新的流行病學(xué)依據(jù)。2、豬肺炎支原體誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞基因差異表達(dá)譜研究。本試驗(yàn)用Mhp刺激體外培養(yǎng)的PAM,以RPMI-1640培養(yǎng)液孵育PAM為對(duì)照,分別作用12h和24h后提取細(xì)胞總RNA,構(gòu)建cDNA文庫(kù),用數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了GO分析、KEGG分析、IPA分析和STRING分析。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Mhp誘導(dǎo)PAM 12小時(shí)后PAM轉(zhuǎn)錄組中有86個(gè)基因顯著差異表達(dá),其中49個(gè)表達(dá)上調(diào),37個(gè)表達(dá)下調(diào)；Mhp誘導(dǎo)PAM 24小時(shí)后PAM轉(zhuǎn)錄組中有889個(gè)基因顯著差異表達(dá),其中517個(gè)表達(dá)上調(diào),372個(gè)表達(dá)下調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)Mhp誘導(dǎo)PAM 12小時(shí)后差異顯著GO富集項(xiàng)有54項(xiàng)：1、“生物進(jìn)程”類別：46項(xiàng),功能描述主要為炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和信號(hào)傳導(dǎo)控制等；2、“分子功能”類別：5項(xiàng),功能描述為細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合和TNF受體結(jié)合；3、“細(xì)胞組分”類別：3項(xiàng),功能描述為細(xì)胞周邊(細(xì)胞外間隙,充滿細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外液)。GO分析發(fā)現(xiàn)Mhp誘導(dǎo)PAM 24小時(shí)后差異顯著GO富集項(xiàng)有128項(xiàng)：1、“生物進(jìn)程”類別：106項(xiàng),功能描述主要為：炎癥反應(yīng)、免疫系統(tǒng)活性、防御反應(yīng)、免疫應(yīng)答和白細(xì)胞激活等；2、“分子功能”類別有11項(xiàng),功能描述主要為：趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合、蛋白結(jié)合和催化活性等；3、“細(xì)胞組分”類別有11項(xiàng),功能描述主要為：細(xì)胞周邊、細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)等。分析發(fā)現(xiàn)Mhp誘導(dǎo)PAM 24小時(shí)后(與誘導(dǎo)12小時(shí)相比),富集項(xiàng)數(shù)量增多,并且相同的GO富集項(xiàng)所含有的差異基因數(shù)量不同程度增加。誘導(dǎo)PAM 12小時(shí)后,Mhp可能主要作用于PAM的細(xì)胞周邊,利用細(xì)胞因子與其受體相互作用啟動(dòng)初始信號(hào)傳遞參與免疫反應(yīng)；誘導(dǎo)PAM 24小時(shí)后,Mhp可能在PAM細(xì)胞內(nèi)外同時(shí)作用,通過信號(hào)傳遞和免疫應(yīng)答反應(yīng)介導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)相應(yīng)的病理癥狀。KEGG分析發(fā)現(xiàn)Mhp誘導(dǎo)PAM 12小時(shí)后,差異基因集中在101個(gè)KEGG富集項(xiàng)中,其中提示與MPS密切相關(guān)的差異基因主要集中在下列4個(gè)KEGG富集項(xiàng)：Toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和抗原遞呈加工通路。Mhp誘導(dǎo)PAM 24小時(shí)后,差異基因集中在250項(xiàng)KEGG富集項(xiàng)中,其中提示與MPS密切相關(guān)的差異基因主要集中在NF-K.B信號(hào)通路、內(nèi)吞作用通路、趨化因子信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體互作通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和抗原遞呈加工通路等7個(gè)KEGG富集項(xiàng)。Mhp誘導(dǎo)PAM 24小時(shí)后(與誘導(dǎo)12小時(shí)相比),KEGG富集項(xiàng)數(shù)量增多,并且相同的KEGG富集項(xiàng)所含有的差異基因數(shù)量不同程度增加。誘導(dǎo)PAM 12小時(shí)后,Mhp可能首先啟動(dòng)Toll受體信號(hào)通路將Mhp相關(guān)信號(hào)向PAM傳遞,并且刺激PAM啟動(dòng)免疫應(yīng)答；誘導(dǎo)PAM24小時(shí)后,Mhp通過信號(hào)傳遞介導(dǎo)吞噬反應(yīng)和趨化因子的激活對(duì)Mhp進(jìn)行反調(diào)控,形成二者相互作用的狀態(tài)。IPA分析發(fā)現(xiàn)Mhp誘導(dǎo)PAM 24小時(shí)后,差異基因相互連接形成25個(gè)內(nèi)部相互作用的子網(wǎng)絡(luò)(子網(wǎng)絡(luò)1-25)。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),提示子網(wǎng)絡(luò)7和子網(wǎng)絡(luò)15中分別有6個(gè)和8個(gè)基因與MPS密切相關(guān)。在子網(wǎng)絡(luò)1-25中與MPS臨床癥狀和病理變化密切相關(guān)的差異基因主要有：IL8、TNFa、CCL3、CCL5、CCL8和TGFβ1等。STRING分析發(fā)現(xiàn)有131個(gè)差異基因編碼蛋白參與了網(wǎng)絡(luò)互作,其中有13個(gè)提示與MPS密切相關(guān)的蛋白相互作用形成CCL子網(wǎng)絡(luò)。編碼CCL子網(wǎng)絡(luò)蛋白的13個(gè)差異基因中有8個(gè)參與了基因互作子網(wǎng)絡(luò)(IPA分析)。根據(jù)DGE技術(shù)檢測(cè)結(jié)果及GO分析、KEGG分析、IPA分析和STRING分析結(jié)果,分析發(fā)現(xiàn)MPS典型病理變化和臨床癥狀形成過程可能與本試驗(yàn)中Mhp通過PAM調(diào)控相關(guān)基因差異表達(dá)密切相關(guān)。Mhp感染豬后形成支氣管周圍炎,PAM向炎灶部位集聚并被激活,激活的PAM可分泌IL1(12小時(shí)表達(dá)量升高3.64倍,24小時(shí)升高8.37倍)和IL8(24小時(shí)表達(dá)量升高2.91倍)等炎性細(xì)胞因子,致使機(jī)體出現(xiàn)炎癥應(yīng)答反應(yīng)過程,以淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞滲出血管外,在CCL3(24小時(shí)表達(dá)量升高5.76倍)、CCL5(24h表達(dá)量升高3.72倍)和CCL8(24小時(shí)表達(dá)量升高23.45倍1等趨化因子作用下向炎灶部位(支氣管和細(xì)支氣管周圍)集聚和浸潤(rùn),進(jìn)一步導(dǎo)致淋巴濾泡形成;Mhp感染豬后形成支氣管周圍炎,活化的PAM向炎灶部位集聚,分泌和釋放TGFβ1(24小時(shí)升高2.91倍),促使肺纖維化和肺間質(zhì)增寬,進(jìn)一步出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎；Mhp感染豬后誘導(dǎo)PAM大量分泌IL1(12小時(shí)表達(dá)量升高3.64倍,24小時(shí)升高8.37倍)和IL8(24小時(shí)表達(dá)量升高2.91倍)。IL1表達(dá)量的升高進(jìn)一步引起的TNF(24小時(shí)表達(dá)量升高3.68倍)分泌。IL8和TNF表達(dá)量升高可促使動(dòng)物機(jī)體出現(xiàn)惡病質(zhì)、發(fā)熱、疲勞和食欲減退,進(jìn)一步促使患豬日益消瘦、疲勞、食欲降低、體重減輕。本研究為MPS的致病機(jī)理研究提供了參考依據(jù),有助于完善Mhp影響PAM功能的分子機(jī)理,為進(jìn)一步闡明Mhp通過PAM促進(jìn)MPS的形成提供了新的線索和依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.28
【目錄】：

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10 閆艷麗;郭宇;張華春;;豬肺炎支原體病原性概述[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王旺;[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2002年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 王貴平;豬肺炎支原體誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞基因差異表達(dá)譜研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 肖國(guó)生;胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌基因芯片檢測(cè)與分型研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

3 劉威;豬肺炎支原體和豬鼻支原體的基因組測(cè)序與比較基因組學(xué)分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 路璐;豬肺炎支原體原位雜交檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

2 李培峰;山西省部分地區(qū)豬肺炎支原體流行病學(xué)調(diào)查及免疫對(duì)比試驗(yàn)[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 丁志勇;豬肺炎支原體血清抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 靳蒙蒙;豬肺炎支原體熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

5 丁敏;實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)豬肺炎支原體研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

6 郭紹華;豬肺炎支原體表面膜蛋白的原核表達(dá)及免疫原性分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 熊煒;豬肺炎支原體疫苗免疫效果的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

8 祝永琴;豬肺炎支原體主要抗原基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的建立[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

9 易兵;豬肺炎支原體免疫膠體金快速診斷試紙的研制[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

10 靳岷;豬肺炎支原體單克隆抗體的制備與初步鑒定[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

  本文關(guān)鍵詞：豬肺炎支原體誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞基因差異表達(dá)譜研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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