本文關鍵詞：豬肺炎支原體誘導豬肺泡巨噬細胞基因差異表達譜研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《湖南農業(yè)大學》 2015年

豬肺炎支原體誘導豬肺泡巨噬細胞基因差異表達譜研究

王貴平  

【摘要】：豬支原體肺炎(MPS),是一種由豬肺炎支原體(Mhp)引起的豬慢性呼吸道病。MPS在世界范圍內流行,在我國也長期存在,嚴重影響了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。MPS逐漸被國內外研究學者所重視,對其研究的相關報道也較多,這些報道多集中在疫苗開發(fā)、病原學、藥物及診斷方面。MPS典型病理變化包括支氣管周圍炎、淋巴細胞浸潤增生、肺肉變和間質性肺炎等；典型臨床癥狀包括喘氣、消瘦及惡病質等。MPS典型病理變化和臨床癥狀發(fā)生機理、相關信號傳導途徑以及相關細胞因子在疾病發(fā)生過程中的作用較少見到相關文獻報道。本試驗將從下列兩方面進行研究。1、長沙市及周邊地區(qū)MPS病原流行病學調查。從長沙市及周邊地區(qū)采集了1260份豬樣品：鼻拭子45份,氣管拭子81份,支氣管肺泡灌洗液469份,豬肺625份和血液40份。對采集的樣品用PCR和序列分析的方法進行了豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)和豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis, Mhr)檢測；對Mhr進行了分離并初步鑒定。結果表明,Mhp和Mhr在長沙市及周邊地區(qū)豬群中,最佳待檢樣品是：冬季收集的屠宰豬支氣管肺泡灌洗液(Mhp)和豬鼻拭子(Mhr)。本研究結果為長沙市及周邊地區(qū)MPS防制及Mhp和Mhr檢測提供了新的流行病學依據。2、豬肺炎支原體誘導豬肺泡巨噬細胞基因差異表達譜研究。本試驗用Mhp刺激體外培養(yǎng)的PAM,以RPMI-1640培養(yǎng)液孵育PAM為對照,分別作用12h和24h后提取細胞總RNA,構建cDNA文庫,用數字基因表達譜(DGE)技術對其進行檢測并對檢測結果進行了GO分析、KEGG分析、IPA分析和STRING分析。結果顯示,與對照組相比,Mhp誘導PAM 12小時后PAM轉錄組中有86個基因顯著差異表達,其中49個表達上調,37個表達下調；Mhp誘導PAM 24小時后PAM轉錄組中有889個基因顯著差異表達,其中517個表達上調,372個表達下調。GO分析發(fā)現Mhp誘導PAM 12小時后差異顯著GO富集項有54項：1、“生物進程”類別：46項,功能描述主要為炎癥反應、免疫應答和信號傳導控制等；2、“分子功能”類別：5項,功能描述為細胞因子活性、細胞因子受體結合和TNF受體結合；3、“細胞組分”類別：3項,功能描述為細胞周邊(細胞外間隙,充滿細胞外基質和細胞外液)。GO分析發(fā)現Mhp誘導PAM 24小時后差異顯著GO富集項有128項：1、“生物進程”類別：106項,功能描述主要為：炎癥反應、免疫系統活性、防御反應、免疫應答和白細胞激活等；2、“分子功能”類別有11項,功能描述主要為：趨化因子活性、趨化因子受體結合、蛋白結合和催化活性等；3、“細胞組分”類別有11項,功能描述主要為：細胞周邊、細胞表面、細胞質和細胞內等。分析發(fā)現Mhp誘導PAM 24小時后(與誘導12小時相比),富集項數量增多,并且相同的GO富集項所含有的差異基因數量不同程度增加。誘導PAM 12小時后,Mhp可能主要作用于PAM的細胞周邊,利用細胞因子與其受體相互作用啟動初始信號傳遞參與免疫反應；誘導PAM 24小時后,Mhp可能在PAM細胞內外同時作用,通過信號傳遞和免疫應答反應介導機體出現相應的病理癥狀。KEGG分析發(fā)現Mhp誘導PAM 12小時后,差異基因集中在101個KEGG富集項中,其中提示與MPS密切相關的差異基因主要集中在下列4個KEGG富集項：Toll樣受體信號通路、細胞因子-細胞因子受體互作通路、T細胞受體信號通路和抗原遞呈加工通路。Mhp誘導PAM 24小時后,差異基因集中在250項KEGG富集項中,其中提示與MPS密切相關的差異基因主要集中在NF-K.B信號通路、內吞作用通路、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、細胞因子-細胞因子受體互作通路、T細胞受體信號通路和抗原遞呈加工通路等7個KEGG富集項。Mhp誘導PAM 24小時后(與誘導12小時相比),KEGG富集項數量增多,并且相同的KEGG富集項所含有的差異基因數量不同程度增加。誘導PAM 12小時后,Mhp可能首先啟動Toll受體信號通路將Mhp相關信號向PAM傳遞,并且刺激PAM啟動免疫應答；誘導PAM24小時后,Mhp通過信號傳遞介導吞噬反應和趨化因子的激活對Mhp進行反調控,形成二者相互作用的狀態(tài)。IPA分析發(fā)現Mhp誘導PAM 24小時后,差異基因相互連接形成25個內部相互作用的子網絡(子網絡1-25)。結合相關文獻,提示子網絡7和子網絡15中分別有6個和8個基因與MPS密切相關。在子網絡1-25中與MPS臨床癥狀和病理變化密切相關的差異基因主要有：IL8、TNFa、CCL3、CCL5、CCL8和TGFβ1等。STRING分析發(fā)現有131個差異基因編碼蛋白參與了網絡互作,其中有13個提示與MPS密切相關的蛋白相互作用形成CCL子網絡。編碼CCL子網絡蛋白的13個差異基因中有8個參與了基因互作子網絡(IPA分析)。根據DGE技術檢測結果及GO分析、KEGG分析、IPA分析和STRING分析結果,分析發(fā)現MPS典型病理變化和臨床癥狀形成過程可能與本試驗中Mhp通過PAM調控相關基因差異表達密切相關。Mhp感染豬后形成支氣管周圍炎,PAM向炎灶部位集聚并被激活,激活的PAM可分泌IL1(12小時表達量升高3.64倍,24小時升高8.37倍)和IL8(24小時表達量升高2.91倍)等炎性細胞因子,致使機體出現炎癥應答反應過程,以淋巴細胞、中性粒細胞為主的炎性細胞滲出血管外,在CCL3(24小時表達量升高5.76倍)、CCL5(24h表達量升高3.72倍)和CCL8(24小時表達量升高23.45倍1等趨化因子作用下向炎灶部位(支氣管和細支氣管周圍)集聚和浸潤,進一步導致淋巴濾泡形成;Mhp感染豬后形成支氣管周圍炎,活化的PAM向炎灶部位集聚,分泌和釋放TGFβ1(24小時升高2.91倍),促使肺纖維化和肺間質增寬,進一步出現間質性肺炎；Mhp感染豬后誘導PAM大量分泌IL1(12小時表達量升高3.64倍,24小時升高8.37倍)和IL8(24小時表達量升高2.91倍)。IL1表達量的升高進一步引起的TNF(24小時表達量升高3.68倍)分泌。IL8和TNF表達量升高可促使動物機體出現惡病質、發(fā)熱、疲勞和食欲減退,進一步促使患豬日益消瘦、疲勞、食欲降低、體重減輕。本研究為MPS的致病機理研究提供了參考依據,有助于完善Mhp影響PAM功能的分子機理,為進一步闡明Mhp通過PAM促進MPS的形成提供了新的線索和依據。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：湖南農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28
【目錄】：

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