發(fā)布時間：2018-03-13 02:33

  本文選題：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲　切入點：排泄分泌蛋白　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病是一種由捻轉(zhuǎn)血矛線蟲引起的小反芻動物的高致病性的重要疾病。重度感染動物每日的失血量可達250 mL以上,嚴重導致動物的產(chǎn)毛量減少、胴體的品質(zhì)下降、貧血甚至死亡。ESPs是由蟲體分泌的一類蛋白分子,其中包括多種蛋白質(zhì)和糖蛋白,具有降低宿主免疫力的作用,并且可能引發(fā)宿主免疫應(yīng)答和病理反應(yīng)。山羊?qū)δ磙D(zhuǎn)血矛線蟲的免疫力的獲得與其品種、年齡、和既往感染有關(guān),但是這些免疫現(xiàn)象的機制尚不清楚。在本文研究中,我們鑒定了 ESP在免疫調(diào)節(jié)中的作用,具體內(nèi)容如下:1.體外捻轉(zhuǎn)血矛線蟲排泄分泌蛋白(HcESPs)對山羊外周單核血細胞(PBMCs)功能的影響將捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲置于37℃,5% C02條件下于RPMI 1640培養(yǎng)基(蟲體密度為為100條/ml)中培養(yǎng)。孵育完成后,取上層培養(yǎng)液,經(jīng)過離心、過濾滅菌、富集、在3-kDa濾器中脫鹽(10mMTris,NaClpH7.4)等過程提取蛋白。收集的HcESP經(jīng)SDS-PAGE檢測顯示,其條帶分布在13 -180 kDa之間,這些條帶可以通過Western Blot被檢測到。免疫熒光分析證實了 HcESP可以和山羊PBMCs結(jié)合。通過PBMCs和HcESP的共孵育的研究,我們發(fā)現(xiàn)了 HcESP在細胞因子產(chǎn)生、細胞增殖、細胞遷移、NO產(chǎn)生和細胞凋亡等方面的作用。ELISA分析HcESP在細胞因子產(chǎn)生中的作用,結(jié)果顯示:HcESP能抑制IL-4和IFNγ的產(chǎn)生,且該抑制作用具有劑量依賴性;可以促進IL-10和IL-17的產(chǎn)生。盡管HcESP可以劑量依賴性地顯著抑制細胞增殖和NO的產(chǎn)生,但其對細胞遷移卻表現(xiàn)出顯著的促進作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)為理解和認識蟲體與宿主間的相互作用和HcESP對山羊PBMCs的調(diào)節(jié)作用提供了基礎(chǔ)。2.體外HcESP與山羊PBMCs結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)組學分析本章研究中,我們主要致力于鑒定在體外條件下結(jié)合到PBMCs上的HcESP蛋白分子。為了達到這個目的,首先我們將HcESP和山羊PBMCs共培養(yǎng),然后經(jīng)免疫熒光分析,確認兩者可以相互結(jié)合。之后從和HcESP共孵育的山羊PBMCs中提取蛋白,以鼠IgGHcESP為探針進行免疫共沉淀分析。通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析免疫共沉淀結(jié)果,以獲得蛋白組分。結(jié)果表明,分離出的蛋白包括肌動蛋白、HSP (70)、肌球蛋白、伸長因子α、14-3-3、泛素、微管蛋白α、微管蛋白FtsZ、組蛋白3、組蛋白4和脂肪瘤HMGIC融合伴侶蛋白、ISE/ ISE自交系基因組支架、WORM6蛋白激酶和蛋白激酶域所含蛋白質(zhì)。根據(jù)基因本體論(GO),我們發(fā)現(xiàn)這些蛋白分子主要為分子功能和生物過程兩類。這些分子主要具有結(jié)合活性(54%)和催化活性(31.42 %)。在細胞生物過程中,這些蛋白主要被劃分在單生物過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)和發(fā)展過程、多細胞生物過程、生長、應(yīng)激、定位、增殖、細胞成分的組織和合成以及運動和信號傳導過程。本項研究首次報道了結(jié)合到山羊PBMCs的HcESP,并對結(jié)合上的HcESP進行GO注釋。3.體內(nèi)不同發(fā)育階段HcESP與山羊PBMCs結(jié)合蛋白的蛋白組學分析本章研究中,我們通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,鑒定出了不同發(fā)育階段HcESP中和山羊PBMCs結(jié)合的蛋白。分別采自人工感染后7天(4期幼蟲)、15天(5期幼蟲)、40天(早期成蟲)和60天(晚期成蟲)蟲體后的血樣。通過Ficoll-Hypaque梯度離心法獲得PBMCs。分離得到的PBMCs通過免疫共沉淀法(Co-IP)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)鑒定結(jié)合到PBMC上的HcESP蛋白。通過SEQUEST搜索,在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.contortus)蛋白數(shù)據(jù)庫中共找出407種HcESP蛋白,這些蛋白可以在不同的感染時期結(jié)合到山羊PBMCs上。與早期成蟲和晚期成蟲相比,在4期幼蟲和5期幼蟲的感染時期識別出的蛋白占有較高的比例。在階段特異性結(jié)合蛋白和非階段特異性蛋白中,有47種蛋白是各發(fā)育階段共有的。被GO注釋的結(jié)合到PBMCs上的蛋白幾乎表達于蟲體的所有階段,并且表現(xiàn)出高結(jié)合和催化活性。在GO注釋中,細胞代謝和單生物過程作為主要生物過程,但是5期幼蟲階段的大多數(shù)蛋白被注釋在定位過程。根據(jù)同源蛋白聚類,我們對所有階段鑒定到未注釋的蛋白進行了功能注釋。通過聚類蛋白株分析,我們對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H. contotus)中一些未命名的ATP結(jié)合盒式蛋白進行鑒定,這些蛋白包括ADP-核糖基化因子和P-糖蛋白-9。4. PBMCs結(jié)合蛋白rHcftt-2分子的克隆、表達及對PBMC功能的調(diào)節(jié)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.contortus)14-3-3蛋白在L4階段體內(nèi)結(jié)合PBMCs上被鑒定,然后根據(jù)成蟲14-3-3的CDS (GenBank: accession No. CDJ94531.1)設(shè)計特異性的引物。Hcftt-2的開放閱讀框(PRF)包含750個核苷酸,編碼一條分子量為28kDa的蛋白,此蛋白含132個氨基酸。據(jù)預測,Hcftt-2蛋白可能含有13個B細胞的表面抗原表位和13個T細胞的表面抗原表位。序列分析表明,它和已知的14-3-3蛋白亞型2具有很高的同源性。免疫熒光驗證了 rHcftt-2對PBMCs的結(jié)合活性;rHcftt-2和山羊PBMCs共孵育后觀察到它對細胞因子產(chǎn)生、細胞細胞增殖、細胞遷移、NO產(chǎn)生和細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。運用ELISA方法檢測rHcftt-2對細胞因子的產(chǎn)生,結(jié)果表明:其可以促進IL-10、IL-17和IFNy的產(chǎn)生,而抑制IL-4的產(chǎn)生。rHcftt-2促進的細胞遷移,并可顯著的抑制PBMCs增殖且具有劑量依賴性。在rHcftt-2作用下,PBMCs產(chǎn)生的NO也顯著減少。我們同樣研究了 PBMCs的凋亡,但對照組和rHcftt-2組沒有顯著差異。本次研究首次提出了 rHcftt-2分子的功能特征,并且我們的結(jié)果為寄生蟲-宿主間的相互作用和rHcftt-2對山羊PBMCs的調(diào)節(jié)作用提供了新的認識和理解。5. PBMCs結(jié)合蛋白ADP糖基化因子小GTP酶基因(HcARF1)的克隆、表達對PBMC功能的影響本章研究中,我們對在L4到成蟲階段能夠結(jié)合到PBMCs上的H.contortusARF基因的CDS (GI: 533372025)設(shè)計的特異性引物進行克隆,其在Gene Bank中的編號為HF964523.1。HcARF1的開放閱讀框長546bp,編碼181個氨基酸,其預測分子量的大小約為20kDa。HF964523.1可能具有6個B細胞抗原表位6個和9個T細胞抗原表位。序列分析顯示,rHcARF1和已知的ARF1蛋白具有高度同源性。rHcARF1的重組蛋白以His標簽融合蛋白的可溶形式在在大腸桿菌(Escherichia coli.)中表達。免疫熒光驗證了 rHcARF1對山羊PBMCs的結(jié)合活性;通過共孵育的方法,我們研究了其在細胞因子分泌、細胞增殖、細胞遷移、NO產(chǎn)生、吞噬作用和細胞凋亡等方面的免疫調(diào)節(jié)作用。rHcARF1可促進IL-4、IL-10、IL-17的產(chǎn)生且呈劑量依賴性,而抑制IFNγ的產(chǎn)生;rHcARF1可顯著地促進PBMC遷移和抑制PBMC的增殖且呈劑量依賴性。除此之外,rHcARF1可顯著誘導細胞凋亡和促進NO的產(chǎn)生。6. PBMCs結(jié)合蛋白富半胱氨酸分泌蛋白抗原5和致病相關(guān)蛋白1(Hc-24)的分子克隆、表達及對PBMCs功能的影響。本章研究中,基于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.contortus)的24kDa排泄分泌蛋白mRNA設(shè)計的特異性引物克隆富半胱氨酸分泌蛋白抗原5和致病相關(guān)蛋白1(Hc-24),其在Gene Bank中的序列編號為AY821551.1。Hc-24的開放閱讀框為609bp,編碼202個氨基酸, 其預測的分子量大約為24kDa。Hc-24可能是B細胞抗原表位上的11條肽鏈和T細胞抗原表位上的3條肽鏈。序列分析表明Hc-24與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.contortus)SCP胞外區(qū)所含的蛋白的同源性為98%,與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.contortus) 24Da排泄分泌蛋白同源性為97%,與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.contortu) cap-2同源性為94%,與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H. contortus) cap-3同源性為93%,與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.contortus) cap-4同源性為78%。富半胱氨酸分泌蛋白抗原5和致病相關(guān)蛋白1(rHc-24)在大腸桿菌中以His標簽融合性可溶蛋白形式表達。免疫熒光驗證了 rHc-24與山羊PBMCs的結(jié)合活性;共孵育后,我們發(fā)現(xiàn)rHc-24在細胞因子分泌、細胞增殖和遷移、NO產(chǎn)生、吞噬作用、細胞凋亡作用等方面具有免疫調(diào)節(jié)效果。rHc-24可促進IL-4、IL-10、IL-17的分泌且呈劑量依賴性,而抑制IFNγ分泌、PBMCs的增殖和NO的產(chǎn)生。同時rHc-24也能誘導PBMCs的遷移和凋亡。
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【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.731
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本文編號：1604439