發(fā)布時間：2018-03-12 18:33

  本文選題：番茄　切入點：葉霉病　出處：《東北農業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：番茄葉霉病由病原菌Cladosporium fulvum(C.fulvum)引起,是栽培番茄中的一種較為嚴重的病害。通過育種獲得含有抗病基因的抗性品種可以在番茄生產中有效地控制葉霉病的發(fā)生,但是新的抗病基因的使用同時也加速了葉霉菌生理小種的分化。目前包括Cf-2、Cf-4和Cf-6等很多基因已經對某些生理小種失去了抗性,所以急需發(fā)掘新的抗病基因來滿足育種的需要;番茄與病原菌C.fulvum的非親和互作遵守基因對基因假說(gene-for-gene)。目前為止關于Cf與Avr基因產物相互作用的研究主要集中在Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9上。Cf-9與Cf-4蛋白的氨基酸序列的一致性達到91%以上,Avr9與Avr4之間卻沒有明顯的同源性,并且它們之間引發(fā)的超敏反應也有很大不同,造成這種差異的具體機制尚不明確,對未知的Cf基因引發(fā)的超敏反應進行研究將有助于拓寬研究思路并加深我們對Cf/Avr互作機理的認識,甚至為抗病育種開辟新的道路。含有Cf-19基因的番茄材料在多年的栽培實踐中表現出了有效的抗病性,可以作為抗性育種的新型候選材料。Cf-19基因在1980年被定位在2號染色體的長臂上,之后對于該基因的研究一直處于停滯狀態(tài),嚴重影響了Cf-19基因在育種中的應用。我們通過對Cf19基因的抗性范圍、抗性特點、遺傳規(guī)律以及基因定位進行系統(tǒng)的研究,并對該基因介導的抗性應答過程中相關的差異表達基因進行篩選和表達模式分析,從而對Cf-19基因從表型抗病特點到基因遺傳特征乃至抗病應答機制有了較為全面的認識,這將為今后Cf-19基因在育種中的應用提供理論依據,同時為Cf19基因的克隆以及進一步研究Cf/Avr互作機理奠定基礎。本研究采用臺盼藍染色、高通量測序技術、熒光定量PCR技術以及cDNA-AFLP等多種方法進行不同方向的研究,主要獲得了以下成果:(1)通過人工接種鑒定確定了Cf-19基因的抗性范圍,該基因對葉霉病菌生理小種1.2.3和1.2.3.4表現免疫,對生理小種1.2.3.4.5和1.2.3.4.9表現高抗,抗性范圍基本涵蓋了我國葉霉病菌生理小種范圍。(2)通過對充分發(fā)生抗病反應的葉片進行染色觀察,對比Cf-4和Cf-9葉片超敏反應壞死斑的分布情況,發(fā)現Cf-19基因介導的超敏反應強度介于Cf-4和Cf-9之間,壞死斑面積較大,整體上大致沿著葉脈附近分布。(3)通過對兩個F2代群體進行人工接種鑒定,統(tǒng)計結果顯示所有母本及F1均表現抗病,所有父本均表現感病,根據適合性測驗結果,F2群體的抗感比均符合3:1分離規(guī)律,BC1群體抗感比均符合1:1分離規(guī)律,Cf-19的遺傳模式符合孟德爾遺傳定律中的顯性單基因遺傳規(guī)律。(4)通過對CGN18423和Moneymaker與病原菌C.fulvum之間的互作過程進行觀察,發(fā)現病原菌對葉表皮細胞的侵染發(fā)生在接種后第4天,第5天開始出現細胞死亡,第5天到第7天之間,形成典型的過敏性壞死斑,第7天至第10天,過敏性壞死斑內部的菌絲逐漸消失,第10天到第21天之間,過敏性壞死斑增多并在有限范圍內擴展。共發(fā)現并總結出7個關鍵時間點:接種后第0、4、5、7、10、15和21天。(5)通過父、母本重測序,SLAF-seq分析,基因功能注釋以及標記開發(fā)和表達模式驗證等多種手段結合,將Cf-19基因定位在1號染色體短臂的2.14Mb區(qū)間內,經篩選獲得2個候選基因位點Solyc01g005870.1.1和Solyc01g006550.2.1,其中Solyc01g006550.2.1與Cf-0為等位基因,位于Cf-4/9基因位點。(6)候選基因及氨基酸序列結構分析顯示,在抗感材料中Solyc01g005870.1.1保守結構域無明顯差別。而本研究中發(fā)現的抗病材料Solyc01g006550.2.1位點基因(KT845954)則為Cf-4/9基因位點上又一新成員,該基因中的60bp堿基片段插入為原Cf-0氨基酸序列提供了N端信號肽結構域,并且由于開放閱讀框的改變而增加了LRR結構的數目。基因進化關系分析顯示,抗病材料中的Solyc01g006550.2.1基因序列與Cf-4和Cf-9兩個功能基因處于同一較高分化水平,且同源關系較近,與其它非功能型Cf-4/9位點基因同源關系較遠。而Solyc01g005870.1.1基因序列則與Cf-0基因處于同一較低分化水平,與其它Cf-4/9位點基因同源關系較遠。(7)開發(fā)了一個與抗病性狀共分離的共顯性SCAR標記P7。該標記在CGN18423中可以擴增出大小為300bp的條帶,在Moneymaker中可以擴增出大小為240bp的條帶,在F1中可以擴增出上述兩條條帶,該標記經過345株F2代植株連鎖分析,以及3個不同基因型F3群體植株的驗證,表現出穩(wěn)定的共分離特性以及靈敏的基因分型功能,可以用于分子標記輔助育種。(8)采用cDNA-AFLP技術對Cf-19基因介導的抗性應答差異表達基因進行篩選,最終獲得成功測序的TDFs共26個,登錄號為JZ717721~JZ717746。其中大部分基因的種類和表達模式與Cf-4和Cf-9介導的抗性應答差異表達基因相同。(9)首次在Cf/Avr互作過程中發(fā)現TDF35(S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(SAMDC)基因)和TDF49(Eli3蛋白基因)。誘導模式表明SAMDC在Cf-19-C.fulvum互作體系中的一個或多個通路中發(fā)揮關鍵作用,而Eli3基因的表達可能依賴于R/Avr基因間互作的發(fā)生。TDF1與S.lycopersicum非特異性脂質轉移蛋白(ns LTP)2-like基因有91%的同源性,并且在抗、感病材料中均表現為接種后上調表達。TDF14對應S.lycopersicum Bax抑制劑基因(BI-1;80%),在CGN18423和Moneymaker中均上調表達;TDF47是鈣依賴性蛋白激酶的同源基因(CDPK),在Cf-19基因介導的防御應答反應中顯著上調表達。(10)建立了有效的病毒誘導的基因沉默侵染技術體系,并成功構建了Cf-19候選基因(Solyc01g005870.1.1和Solyc01g006550.2.1),以及部分抗病應答相關基因的基因沉默載體(VIGS-TRV2)。
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【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S436.412.1

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1 趙婷婷;番茄抗葉霉病基因Cf-19的精細定位及抗病應答基因篩選[D];東北農業(yè)大學;2016年

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本文編號：1602769