本文選題：番茄　切入點：葉霉病　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：番茄葉霉病由病原菌Cladosporium fulvum(C.fulvum)引起,是栽培番茄中的一種較為嚴(yán)重的病害。通過育種獲得含有抗病基因的抗性品種可以在番茄生產(chǎn)中有效地控制葉霉病的發(fā)生,但是新的抗病基因的使用同時也加速了葉霉菌生理小種的分化。目前包括Cf-2、Cf-4和Cf-6等很多基因已經(jīng)對某些生理小種失去了抗性,所以急需發(fā)掘新的抗病基因來滿足育種的需要;番茄與病原菌C.fulvum的非親和互作遵守基因?qū)蚣僬f(gene-for-gene)。目前為止關(guān)于Cf與Avr基因產(chǎn)物相互作用的研究主要集中在Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9上。Cf-9與Cf-4蛋白的氨基酸序列的一致性達(dá)到91%以上,Avr9與Avr4之間卻沒有明顯的同源性,并且它們之間引發(fā)的超敏反應(yīng)也有很大不同,造成這種差異的具體機(jī)制尚不明確,對未知的Cf基因引發(fā)的超敏反應(yīng)進(jìn)行研究將有助于拓寬研究思路并加深我們對Cf/Avr互作機(jī)理的認(rèn)識,甚至為抗病育種開辟新的道路。含有Cf-19基因的番茄材料在多年的栽培實踐中表現(xiàn)出了有效的抗病性,可以作為抗性育種的新型候選材料。Cf-19基因在1980年被定位在2號染色體的長臂上,之后對于該基因的研究一直處于停滯狀態(tài),嚴(yán)重影響了Cf-19基因在育種中的應(yīng)用。我們通過對Cf19基因的抗性范圍、抗性特點、遺傳規(guī)律以及基因定位進(jìn)行系統(tǒng)的研究,并對該基因介導(dǎo)的抗性應(yīng)答過程中相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選和表達(dá)模式分析,從而對Cf-19基因從表型抗病特點到基因遺傳特征乃至抗病應(yīng)答機(jī)制有了較為全面的認(rèn)識,這將為今后Cf-19基因在育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù),同時為Cf19基因的克隆以及進(jìn)一步研究Cf/Avr互作機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本研究采用臺盼藍(lán)染色、高通量測序技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)以及cDNA-AFLP等多種方法進(jìn)行不同方向的研究,主要獲得了以下成果:(1)通過人工接種鑒定確定了Cf-19基因的抗性范圍,該基因?qū)θ~霉病菌生理小種1.2.3和1.2.3.4表現(xiàn)免疫,對生理小種1.2.3.4.5和1.2.3.4.9表現(xiàn)高抗,抗性范圍基本涵蓋了我國葉霉病菌生理小種范圍。(2)通過對充分發(fā)生抗病反應(yīng)的葉片進(jìn)行染色觀察,對比Cf-4和Cf-9葉片超敏反應(yīng)壞死斑的分布情況,發(fā)現(xiàn)Cf-19基因介導(dǎo)的超敏反應(yīng)強(qiáng)度介于Cf-4和Cf-9之間,壞死斑面積較大,整體上大致沿著葉脈附近分布。(3)通過對兩個F2代群體進(jìn)行人工接種鑒定,統(tǒng)計結(jié)果顯示所有母本及F1均表現(xiàn)抗病,所有父本均表現(xiàn)感病,根據(jù)適合性測驗結(jié)果,F2群體的抗感比均符合3:1分離規(guī)律,BC1群體抗感比均符合1:1分離規(guī)律,Cf-19的遺傳模式符合孟德爾遺傳定律中的顯性單基因遺傳規(guī)律。(4)通過對CGN18423和Moneymaker與病原菌C.fulvum之間的互作過程進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)病原菌對葉表皮細(xì)胞的侵染發(fā)生在接種后第4天,第5天開始出現(xiàn)細(xì)胞死亡,第5天到第7天之間,形成典型的過敏性壞死斑,第7天至第10天,過敏性壞死斑內(nèi)部的菌絲逐漸消失,第10天到第21天之間,過敏性壞死斑增多并在有限范圍內(nèi)擴(kuò)展。共發(fā)現(xiàn)并總結(jié)出7個關(guān)鍵時間點:接種后第0、4、5、7、10、15和21天。(5)通過父、母本重測序,SLAF-seq分析,基因功能注釋以及標(biāo)記開發(fā)和表達(dá)模式驗證等多種手段結(jié)合,將Cf-19基因定位在1號染色體短臂的2.14Mb區(qū)間內(nèi),經(jīng)篩選獲得2個候選基因位點Solyc01g005870.1.1和Solyc01g006550.2.1,其中Solyc01g006550.2.1與Cf-0為等位基因,位于Cf-4/9基因位點。(6)候選基因及氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析顯示,在抗感材料中Solyc01g005870.1.1保守結(jié)構(gòu)域無明顯差別。而本研究中發(fā)現(xiàn)的抗病材料Solyc01g006550.2.1位點基因(KT845954)則為Cf-4/9基因位點上又一新成員,該基因中的60bp堿基片段插入為原Cf-0氨基酸序列提供了N端信號肽結(jié)構(gòu)域,并且由于開放閱讀框的改變而增加了LRR結(jié)構(gòu)的數(shù)目�；蜻M(jìn)化關(guān)系分析顯示,抗病材料中的Solyc01g006550.2.1基因序列與Cf-4和Cf-9兩個功能基因處于同一較高分化水平,且同源關(guān)系較近,與其它非功能型Cf-4/9位點基因同源關(guān)系較遠(yuǎn)。而Solyc01g005870.1.1基因序列則與Cf-0基因處于同一較低分化水平,與其它Cf-4/9位點基因同源關(guān)系較遠(yuǎn)。(7)開發(fā)了一個與抗病性狀共分離的共顯性SCAR標(biāo)記P7。該標(biāo)記在CGN18423中可以擴(kuò)增出大小為300bp的條帶,在Moneymaker中可以擴(kuò)增出大小為240bp的條帶,在F1中可以擴(kuò)增出上述兩條條帶,該標(biāo)記經(jīng)過345株F2代植株連鎖分析,以及3個不同基因型F3群體植株的驗證,表現(xiàn)出穩(wěn)定的共分離特性以及靈敏的基因分型功能,可以用于分子標(biāo)記輔助育種。(8)采用cDNA-AFLP技術(shù)對Cf-19基因介導(dǎo)的抗性應(yīng)答差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選,最終獲得成功測序的TDFs共26個,登錄號為JZ717721~JZ717746。其中大部分基因的種類和表達(dá)模式與Cf-4和Cf-9介導(dǎo)的抗性應(yīng)答差異表達(dá)基因相同。(9)首次在Cf/Avr互作過程中發(fā)現(xiàn)TDF35(S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(SAMDC)基因)和TDF49(Eli3蛋白基因)。誘導(dǎo)模式表明SAMDC在Cf-19-C.fulvum互作體系中的一個或多個通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用,而Eli3基因的表達(dá)可能依賴于R/Avr基因間互作的發(fā)生。TDF1與S.lycopersicum非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(ns LTP)2-like基因有91%的同源性,并且在抗、感病材料中均表現(xiàn)為接種后上調(diào)表達(dá)。TDF14對應(yīng)S.lycopersicum Bax抑制劑基因(BI-1;80%),在CGN18423和Moneymaker中均上調(diào)表達(dá);TDF47是鈣依賴性蛋白激酶的同源基因(CDPK),在Cf-19基因介導(dǎo)的防御應(yīng)答反應(yīng)中顯著上調(diào)表達(dá)。(10)建立了有效的病毒誘導(dǎo)的基因沉默侵染技術(shù)體系,并成功構(gòu)建了Cf-19候選基因(Solyc01g005870.1.1和Solyc01g006550.2.1),以及部分抗病應(yīng)答相關(guān)基因的基因沉默載體(VIGS-TRV2)。
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【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.412.1

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1 趙婷婷;番茄抗葉霉病基因Cf-19的精細(xì)定位及抗病應(yīng)答基因篩選[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

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本文編號：1602769