本文選題：蛋白激酶R　切入點(diǎn)：雙鏈RNA　出處：《南昌大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：PKR是脊椎動物抗病毒免疫反應(yīng)的主要功能蛋白,它可以在病毒感染和其它多種脅迫刺激下,通過介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng),并且通過抑制細(xì)胞蛋白合成導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。PKR屬于Ser/Thr蛋白激酶家族,又屬于ds RNA結(jié)合蛋白家族。其分子結(jié)構(gòu)包括N端的ds RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ds RBD)和C端的激酶活性結(jié)構(gòu)域(Kinase Domian,KD)。其中ds RBD對KD的激酶活性起著調(diào)節(jié)作用。PKR的ds RBD一般由2個(哺乳動物)或3個(少數(shù)魚類)ds RNA結(jié)合模體(ds RBM)構(gòu)成。多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,少數(shù)含有3個ds RBM的魚類PKR的ds RBM在結(jié)構(gòu)上具有很大的相似性,但在進(jìn)化上卻有不同的來源。本研究對本實(shí)驗(yàn)室克隆的草魚(Ctenopharyngodon idella)PKR(Ci PKR)所含有的3個ds RBM進(jìn)行了分析和鑒定。Ci PKR的ds RBM具有典型的ds RBM的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),并含有的與其ds RNA結(jié)合功能密切相關(guān)的保守氨基酸區(qū)域。在Ci PKR的3個ds RBM里面,ds RBM1僅在少數(shù)魚類PKR中發(fā)現(xiàn);而ds RBM2和ds RBM3在進(jìn)化上分別與哺乳動物PKR的ds RBM1和ds RBM2相近。原核表達(dá)單獨(dú)的ds RBM蛋白的二聚化實(shí)驗(yàn)顯示:Ci PKR的ds RBM1和ds RBM2不僅能進(jìn)行同二聚化,還能進(jìn)行同多聚化;但是,ds RBM3就像哺乳動物ds RBM2一樣,只能進(jìn)行同二聚化,不能進(jìn)行同多聚化;同時,原核表達(dá)含2個或3個ds RBM的ds RBM1-2,ds RBM2-3和ds RBM1-2-3蛋白也是既能進(jìn)行同二聚化,又能進(jìn)行同多聚化。Poly I:C對原核表達(dá)各ds RBM蛋白的pull-down實(shí)驗(yàn)顯示:單獨(dú)一個ds RBM并不能明顯地與Poly I:C結(jié)合;而含有2個或3個ds RBM的蛋白則能明顯地與Poly I:C結(jié)合。為了進(jìn)一步研究ds RBM對Ci PKR激酶活性的影響,本研究設(shè)計構(gòu)建了一系列含有不同種類和不同數(shù)量的Ci PKR突變體,包括Ci PKR-Δds RBM2-3、Ci PKR-Δds RBM1,3、Ci PKR-Δds RBM1-2、Ci PKR-Δds RBM3、Ci PKR-Δds RBM1。并將這些重組質(zhì)粒和帶有啟動子和熒光素酶基因的質(zhì)粒PGL3共轉(zhuǎn)染到草魚腎(CIK)細(xì)胞,然后分析它們對CIK細(xì)胞內(nèi)熒光素酶蛋白翻譯抑制的差異。結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)空載pc DNA3.1質(zhì)粒的CIK細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)Ci PKR-wt、Ci PKR-Δds RBM2-3、Ci PKR-Δds RBM1,3、Ci PKR-Δds RBM1-2、Ci PKR-Δds RBM3和Ci PKR-Δds RBM1質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶蛋白翻譯分別被抑制了78.7%、15%、0、0.5%,、61.8%、67.3%。因此,含有1個ds RBM的Ci PKR突變體對CIK細(xì)胞合成熒光素酶蛋白的抑制作用極小;含有2個ds RBM的Ci PKR突變體具有較強(qiáng)的抑制作用;而Ci PKR-wt則具有最強(qiáng)的抑制作用。同樣,通過MTT和CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測CIK細(xì)胞在分別轉(zhuǎn)染以上各質(zhì)粒后的細(xì)胞活力,發(fā)現(xiàn)與空白對比,在轉(zhuǎn)染后24 h它們的細(xì)胞活力變化很小;在轉(zhuǎn)染后48 h,含有單個ds RBM的Ci PKR突變體幾乎不具有抑制細(xì)胞活力的作用;含有2個ds RBM的Ci PKR具有較強(qiáng)的抑制細(xì)胞活力的作用;而Ci PKR-wt具有最強(qiáng)的抑制活力作用。進(jìn)一步的細(xì)胞計數(shù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí),轉(zhuǎn)染Ci PKR-wt和Ci PKR-Δds RBM3,Ci PKR-Δds RBM1重組質(zhì)粒具有較強(qiáng)的降低細(xì)胞數(shù)量的作用。因此,Ci PKR的N端串聯(lián)排列2個ds RBM對其抑制蛋白翻譯功能是必需的。Ci PKR的N端多含有1個ds RBM1增強(qiáng)了它抑制蛋白合成的功能。為了進(jìn)一步研究Ci PKR在抗病毒免疫反應(yīng)中抑制蛋白翻譯作用和細(xì)胞抗病毒免疫細(xì)胞因子合成的關(guān)系。本研究進(jìn)一步克隆了Ci PKR抑制蛋白翻譯作用的主要靶蛋白,真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(e IF2α)。首次發(fā)現(xiàn)草魚存在2個e IF2α,分別是Cie IF2α(Accession number:KJ126860.1,GI:597914306)和Cie IF2α-like(Accession number:KJ126861.1,GI:597914308)。本研究還克隆了細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)中,可能存在繞過Ci PKR對細(xì)胞蛋白合成抑制作用,與抗病毒細(xì)胞免疫因子蛋白翻譯有關(guān)基因Cie IF2A(Accession number:KJ126862.1,GI:597914310)。半定量和轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析顯示,在抗草魚出血病毒(GCHV)的抗病毒免疫反應(yīng)中,Cie IF2α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)在24 h內(nèi)降低,而Cie IF2A的轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)。其轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式的差異說明兩者在CIK細(xì)胞抗病毒免疫反應(yīng)中的蛋白合成可能起著不同的作用,并且說明在CIK細(xì)胞內(nèi)可能存在繞過一種Ci PKR的機(jī)制,即依賴于Cie IF2A或Cie IF2α-like的蛋白翻譯途徑。對Ci PKR、Cie IF2α和Cie IF2α-like進(jìn)行了原核表達(dá),并用以免疫大白兔制備多克隆抗體。通過ELISA和WB實(shí)驗(yàn)檢測,證明制備的多克隆抗體是有效的。通過設(shè)計合成Ci PKR特異的si RNA,在GCHV刺激CIK細(xì)胞后對Ci PKR進(jìn)行knockdown,然后用Q-PCR和WB的方法分析CIK細(xì)胞Ci PKR和Ci IFN的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ci PKR特異的si RNA,能有效降低Ci PKR的m RNA和蛋白表達(dá)水平,但Ci IFN的m RNA和蛋白表達(dá)水平卻發(fā)生了上調(diào)。用PKR的抑制劑2-AP作用于GCHV刺激后的CIK細(xì)胞,Ci IFN的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也有一定的上調(diào)。說明CIK細(xì)胞在Ci PKR敲降或Ci PKR活性被抑制后,Ci IFN的表達(dá)可能經(jīng)由繞過PKR/NF-κB的表達(dá)途徑。用TLR受體的抑制劑CQ作用于GCHV刺激后的CIK細(xì)胞,Ci PKR和Ci IFN的表達(dá)不僅沒有上調(diào),還有一定的下降。說明GCHV刺激CIK細(xì)胞引起Ci PKR和Ci IFN的表達(dá)上調(diào)經(jīng)過了TLR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 胡有生;DsRBM對草魚PKR抑制蛋白翻譯功能的影響研究[D];南昌大學(xué);2016年

，

本文編號：1602561