本文關(guān)鍵詞：日本乙型腦炎病毒誘導(dǎo)宿主細胞自噬的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2015年

日本乙型腦炎病毒誘導(dǎo)宿主細胞自噬的研究

王秀錦  

【摘要】：日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是一種重要的人畜共患病原,其宿主范圍廣泛,可以感染嚙齒動物、家畜及人,還可以感染多種傳代細胞系。豬是JEV的儲存宿主,感染后可導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn),產(chǎn)死胎、畸胎、木乃伊胎等,給養(yǎng)豬業(yè)造成經(jīng)濟損失。此外,JEV還可以通過蚊蟲叮咬傳播給人,造成感染者癱瘓甚至死亡。因此,深入研究JEV的致病機制具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本實驗室2008年-2011年在國內(nèi)部分規(guī)�；i場開展的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,我國豬群中JEV抗體陽性率普遍較高,且現(xiàn)階段JEV流行優(yōu)勢毒株與傳統(tǒng)疫苗毒株間已存在較大差異。目前有關(guān)JEV的致病機制尚未完全闡明,本研究以細胞自噬現(xiàn)象為切入點,圍繞病毒復(fù)制與細胞自噬的相關(guān)性展開研究,旨在從先天性免疫角度為JEV分子致病機制的研究提供新線索。運用透射電鏡、Western Blot和激光共聚焦免疫熒光等技術(shù),對JEV疫苗株SA14-14-2感染后BHK-21、PK-15和N2A細胞的自噬活性分別進行了定性檢測和定量分析。結(jié)果顯示,JEV感染可導(dǎo)致3種宿主細胞胞漿內(nèi)產(chǎn)生大量雙層膜和單層膜的自噬體樣囊泡,同時胞內(nèi)自噬體標志分子LC3-Ⅱ含量、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化量以及宿主細胞的自噬流量均顯著提高；JEV感染后,宿主細胞內(nèi)LC3信號大量增加,呈點狀聚集,且該信號能與JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1發(fā)生共定位。以上結(jié)果表明,JEV感染能夠誘導(dǎo)多種宿主細胞發(fā)生自噬。利用自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin、自噬抑制劑3-MA及特異性siRNAs改變宿主細胞的自噬活性,而后接種JEV,檢測病毒在細胞中復(fù)制能力的變化。結(jié)果顯示,Rapamycin誘導(dǎo)細胞自噬后,感染細胞內(nèi)外的病毒滴度顯著增加,而用3-MA或siRNA抑制細胞自噬活性后,感染細胞內(nèi)外的病毒滴度顯著降低。結(jié)果表明,宿主細胞自噬活性的改變影響了病毒在細胞中的增殖過程,且自噬活性的增加有利于JEV在細胞中的增殖。以PCMV為載體,構(gòu)建JEV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白共9個真核表達重組質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染BHK-21細胞,分析病毒蛋白與BHK-21細胞白噬發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果顯示,JEV結(jié)構(gòu)蛋白C、M及非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的表達能夠提高細胞內(nèi)自噬標志分子LC3-Ⅱ的含量及自噬體樣囊泡的數(shù)量,且蛋白標簽與細胞內(nèi)LC3呈現(xiàn)共定位信號。提示,JEV結(jié)構(gòu)蛋白C、M及非結(jié)構(gòu)蛋白NS3是病毒誘導(dǎo)細胞自噬的主要蛋白。應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)及激光免疫共聚焦技術(shù),分析了表達JEVSA14-14-2各蛋白的293T細胞中自噬參與蛋白IRGM在病毒復(fù)制中的可能作用。結(jié)果表明,自噬參與蛋白IRGM的沉默表達,可以顯著降低病毒在細胞中的增殖滴度,且IRGM能夠與JEVNS3發(fā)生明顯共定位。綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實了JEV能夠誘導(dǎo)宿主細胞發(fā)生自噬,且細胞自噬的發(fā)生有利于JEV在細胞中的進一步增殖；病毒的結(jié)構(gòu)蛋白C、M及非結(jié)構(gòu)蛋白NS3在誘導(dǎo)細胞自噬過程中發(fā)揮主要作用。研究結(jié)果為解析JEV與宿主細胞的相互作用提供了線索,也為JEV分子致病機制研究開辟了新的思路。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3
【目錄】：

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