發(fā)布時間：2018-03-05 04:12

  本文選題：小鵝瘟病毒　切入點(diǎn)：抗原表位富集區(qū)　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：小鵝瘟的病原為小鵝瘟病毒(Goose parvovirus, GPV),主要導(dǎo)致雛鵝發(fā)病,該病傳播快,死亡率高,制約著鵝業(yè)養(yǎng)殖的健康發(fā)展�，F(xiàn)有弱毒活疫苗和小鵝瘟抗體的廣泛應(yīng)用,在我國小鵝瘟疫病防控過程中發(fā)揮了巨大的作用。伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和疫苗產(chǎn)業(yè)化工藝的的革新,基因工程亞單位疫苗成為一種新型廣泛推廣應(yīng)用的候選疫苗�；蚬こ虂唵挝灰呙缇哂猩a(chǎn)成本低、抗原含量高、無外源病毒、無毒力返強(qiáng)的優(yōu)勢。本研究針對小鵝瘟的保護(hù)性抗原VP3結(jié)構(gòu)蛋白,選取B細(xì)胞抗原表位富集區(qū),開展原核表達(dá)、規(guī)�；l(fā)酵制備及其免疫原性研究工作,以期制備的亞單位抗原在小鵝瘟疫病的綜合防控過程中,發(fā)揮其應(yīng)有的作用,積極推進(jìn)小鵝瘟疫病的凈化。在山東地區(qū)開展了小鵝瘟的流行病學(xué)調(diào)查,采集山東地區(qū)某規(guī)�；B(yǎng)殖場疑似小鵝瘟病料,開展了GPV的分離鑒定、鵝胚中增值特性、3日齡雛鵝攻毒試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、GPV VP3基因序列分析等工作；通過一系列的鑒定工作證實(shí)證實(shí)成功分離一株GPV毒株,該病毒第5代培養(yǎng)物鵝胚增殖死亡的高峰為96 h,其ELD50為10-6.32/0.2 mL,對3日齡雛鵝具有較強(qiáng)的致病性,LD50為10-2.2866/0.2 mL；該分離株克隆測序獲得的VP3基因序列,與國內(nèi)外參比毒株的同源性均在95.8%以上,推導(dǎo)的氨基酸同源性在97.5%以上,命名該GPV毒株為BZ株。為了獲得高效表達(dá)且具有免疫原性的小鵝瘟亞單位抗原,以GPV BZ株為模板,分析預(yù)測GPV結(jié)構(gòu)蛋白VP3的B細(xì)胞抗原表位分布,并選中預(yù)測的一段抗原表位富集區(qū)為研究目標(biāo),將其成功克隆構(gòu)建了pET-32a-VP3原核表達(dá)載體,在實(shí)驗(yàn)室條件下實(shí)現(xiàn)了VP3-2蛋白的可溶性表達(dá),可溶性的VP3-2蛋白免疫SPF雞制備抗血清,中和效價(jià)能夠達(dá)到10-1.91,說明該重組GPV亞單位蛋白抗原具有很好的中和抗體產(chǎn)生能力。為了實(shí)現(xiàn)具有良好免疫原性的GPV VP3-2蛋白的大規(guī)模生產(chǎn),本研究通過細(xì)菌發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù),開展VP3-2蛋白的高密度發(fā)酵工作。高密度發(fā)酵研究證實(shí),溶氧反饋控制補(bǔ)料適合VP3-2蛋白的規(guī)�；a(chǎn)：通過在發(fā)酵過程中溶氧反饋補(bǔ)充調(diào)節(jié)葡萄糖溶液,控制溶氧水平分別在60%(0-4 h)、30%(4-10 h),使乙酸積累量大大降低至0.716g/L,細(xì)胞的吸光度(OD600)數(shù)值為2.256,VP3-2蛋白包涵體產(chǎn)量為85.64 mg/L。通過“溶氧反饋-分階段控制”補(bǔ)料方案,實(shí)現(xiàn)了GPV VP3-2蛋白高效表達(dá)。高密度發(fā)酵表達(dá)的小鵝瘟亞單位抗原VP3-2蛋白產(chǎn)物為包涵體,為此開展了該蛋白變性復(fù)性工藝優(yōu)化工作,形成了以CBS (pH9.6)為緩沖液、6M的尿素為變性劑、稀釋復(fù)性的抗原后續(xù)處理工藝,質(zhì)量檢驗(yàn)證實(shí)該工藝成功制備了具有良好免疫原性的亞單位疫苗抗原；以復(fù)性的VP3-2蛋白作為疫苗抗原,配制了小鵝瘟蜂膠亞單位疫苗,進(jìn)行了常規(guī)檢驗(yàn)及安全性檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、抗體持續(xù)期檢驗(yàn)等,證實(shí)原核表達(dá)的VP3-2蛋白能夠作為新型小鵝瘟疫苗的候選抗原。
[Abstract]:The pathogen of Gosling plague is Goose parvovirus (GPVV), which mainly causes the disease in goslings. The disease spreads rapidly and the mortality rate is high, which restricts the healthy development of goose breeding. The existing live attenuated vaccine and goose plague antibody are widely used. It has played a great role in the prevention and control of goose plague in China. With the development of molecular biology technology and the innovation of vaccine industrialization technology, Genetic engineering subunit vaccine has become a new candidate vaccine for wide application. It has the advantages of low production cost, high antigen content and no exogenous virus. This study aimed at the protective antigen VP3 structural protein of Gosling plague, selected B cell antigen epitope rich region, carried out prokaryotic expression, large-scale fermentation preparation and immunogenicity study. It was hoped that the prepared subunit antigen could play its due role in the comprehensive prevention and control of goose plague and actively promote the purification of goose plague. The epidemiological investigation of Gosling plague was carried out in Shandong Province. The suspected Gosling blast materials were collected from a large scale breeding farm in Shandong Province, and the isolation and identification of GPV were carried out, the virus attack test of 3-day-old goslings in goose embryo and the sequence analysis of VP3 gene were carried out in the neutralization test. A successful isolation of GPV strain was confirmed by a series of identification work. The peak of embryo proliferation and death was 96 h, the ELD50 was 10-6.32 / 0.2 mL, LD50 was 10-2.2866 / 0.2 mL for 3-day-old goslings, and the cloned sequence of VP3 gene was obtained. The homology of the strain with reference strain at home and abroad was above 95.8%, and the deduced amino acid homology was more than 97.5%. The strain of GPV was named as BZ strain. In order to obtain the highly expressed and immunogenicity goose plague subunit antigen, GPV BZ strain was used as template. The B cell epitope distribution of GPV structural protein VP3 was analyzed and predicted, and a segment of antigen epitope rich region was selected as the research objective. The prokaryotic expression vector of pET-32a-VP3 was successfully cloned and constructed. The soluble expression of VP3-2 protein was realized in laboratory. The soluble VP3-2 protein was immunized with SPF chicken to prepare antiserum. The neutralization titer can reach 10-1.91, which indicates that the recombinant GPV subunit protein antigen has a good ability to produce neutralizing antibody. In order to realize the large-scale production of GPV VP3-2 protein with good immunogenicity, the technique of bacterial fermentor culture was used in this study. High density fermentation of VP3-2 protein. The study of high density fermentation confirmed that the feedstock controlled by dissolved oxygen was suitable for the large-scale production of VP3-2 protein: the glucose solution was supplemented by dissolved oxygen feedback during fermentation. Controlling dissolved oxygen levels at 600-4 h and 30mg / L for 4-10 h, so that the accumulation of acetic acid was significantly reduced to 0.716 g / L, and the cell absorbance was 2.256 渭 g / L, and the protein inclusion body output was 85.64 mg / L. Through the "dissolved oxygen feedback-phased control" feeding scheme, The high efficient expression of GPV VP3-2 protein was achieved. The high density fermentative expression of goose blast subunit antigen VP3-2 protein product was used as inclusion body. The denaturation and renaturation process of the protein was optimized, and urea with CBS pH 9.6) as buffer was formed as denaturant. The process of dilution and renaturation of antigens showed that the subunit vaccine antigen with good immunogenicity was successfully prepared by this process, and the vaccine of goose blast propolis subunit was prepared by renaturation of VP3-2 protein as vaccine antigen. Routine and safety tests, potency tests and antibody duration tests were carried out to confirm that the prokaryotic expressed VP3-2 protein could be used as a candidate antigen for a novel Gosling plague vaccine.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1568683