發(fā)布時間：2018-02-28 23:22

  本文關(guān)鍵詞： 甜橙 非生物逆境 多胺分解代謝 銅胺氧化酶 多胺氧化酶 活性氧　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：柑橘是世界上最重要的果樹之一,然而各種生物脅迫和非生物脅迫嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)量和質(zhì)量。多胺是普遍存在于高等植物中的一類低分子量脂肪族陽離子聚合物,其分解代謝在調(diào)節(jié)脅迫應(yīng)答中多胺動態(tài)平衡中起著重要作用。多胺分解代謝主要由銅胺氧化酶(CuAO)和多胺氧化酶(PAO)催化完成。本研究利用甜橙基因組數(shù)據(jù)挖掘甜橙CuAO和PAO家族成員,分析其表達(dá)模式,最后利用遺傳轉(zhuǎn)化及生物化學(xué)技術(shù)揭示了部分成員的功能。主要結(jié)果如下:1.通過搜索比對共得到8個甜橙CuAO候選基因(命名為CsCuAO1-CsCuAO8),分別位于3條染色體上,編碼區(qū)大小分別從1389 bp到2328bp。等電點(diǎn)和相對分子量預(yù)測結(jié)果顯示甜橙CuAO蛋白等電點(diǎn)范圍為6.11-8.77,相對分子量為52.1-82.8 kDa。親緣關(guān)系分析顯示CsCuAO基因家族成員可以分為兩類。CsCuAO擁有植物CuAO高度保守的33個氨基酸殘基,并且含有C端或者N端信號肽序列。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)CsCuAO1-3和CsCuAO5在根、莖、葉和子葉中表達(dá)量較高,其它基因表達(dá)水平較低。外源腐胺(Put),亞精胺(Spd)和精胺(Spm)誘導(dǎo)CsCuAO基因表達(dá)上升。此外,ABA、低溫、鹽害及滲透脅迫抑制CsCuAO基因(CsCuAO1-2,CsCuAO5,CsCuAO6和CsCuAO8)表達(dá)但誘導(dǎo)CsCuAO3和CsCuAO7上調(diào)表達(dá)。2.比對分析共發(fā)現(xiàn)6個甜橙PAO候選基因CsPAO1-CsPAO6。根據(jù)親緣關(guān)系可將CsPAO基因分為四類。CsPAO基因在根中表達(dá)水平高于莖、葉和子葉中的水平。CsPAO基因表達(dá)也受到外源多胺處理的誘導(dǎo),根據(jù)其表達(dá)模式推測CsPAO4基因可能參與多胺末端分解代謝而其余CsPAO基因可能參與多胺回復(fù)反應(yīng)代謝。同時在煙草中超表達(dá)CsPAO3基因可以顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草體內(nèi)Put含量,并且降低Spd和Spm含量,說明該基因確實參與多胺回復(fù)反應(yīng)代謝。另外,CsPAO基因同時受到ABA、低溫、鹽害和滲透脅迫的誘導(dǎo),說明其可能參與激素和逆境脅迫應(yīng)答。分析CsPAO基因啟動子序列發(fā)現(xiàn)共有203個與激素和脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。3.為闡明PAO基因功能,通過遺傳轉(zhuǎn)化和生物化學(xué)技術(shù)分析了CsPAO4在多胺分解代謝和逆境應(yīng)答中的功能。CsPAO4基因位于質(zhì)外體中。體外底物催化結(jié)合HPLC檢測,表明CsPAO4可以催化Spd和Spm并生成二氨基丙烷(Dap),說明該蛋白能夠參與多胺末端分解代謝。在煙草中超表達(dá)CsPAO4基因,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株P(guān)AO酶活性顯著高于野生型,而Spd和Spm含量顯著降低,同時Dap和過氧化氫(H2O2)含量顯著上升。鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草比野生型煙草具有更快的種子發(fā)芽速度和更高的發(fā)芽率。然而,鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株草營養(yǎng)生長和根系伸長均受到明顯抑制,與此同時轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)積累更多的H2O2并且具有明顯的細(xì)胞程序性死亡(PCD)現(xiàn)象。而外源加入過氧化氫清除劑(CAT)在一定程度上恢復(fù)轉(zhuǎn)基因植株根系生長和營養(yǎng)生長。此外,外源Spm處理抑制轉(zhuǎn)基因幼苗根系生長。
[Abstract]:Citrus is one of the most important fruit trees in the world. However, a variety of biological and abiotic stresses seriously affect the yield and quality of citrus. Polyamines are a kind of low molecular weight aliphatic cationic polymers widely found in higher plants. Its catabolism plays an important role in regulating the dynamic balance of polyamines in stress response. Polyamine catabolism is mainly catalyzed by copper amine oxidase (CuAO) and polyamine oxidase (PAO). In this study, sweet orange genome data were used to mine sweet orange. Members of the CuAO and PAO families, The main results are as follows: 1. Eight CuAO candidate genes (named CsCuAO1-CsCuAO8, named CsCuAO1-CsCuAO8) were obtained by searching and comparing. The results of isoelectric point and relative molecular weight prediction showed that the isoelectric point range of sweet orange CuAO protein was 6.11-8.77 and the relative molecular weight was 52.1-82.8 kDa. the genetic relationship analysis showed that the members of CsCuAO gene family could be classified into two classes. There are 33 amino acid residues which are highly conserved in plant CuAO. The expression of CsCuAO1-3 and CsCuAO5 was found to be high in root, stem, leaf and cotyledon. The expression level of other genes was low. Exogenous putrescine, spermidine (SPD) and spermidine (SPM) increased the expression of CsCuAO gene. Salt injury and osmotic stress inhibited the expression of CsCuAO1-2CsCuAO5, CsCuAO6 and CsCuAO8, but induced up-regulated expression of CsCuAO6 and CsCuAO8 in CsCuAO3 and CsCuAO7. Six candidate genes of PAO, CsPAO1-CsPAO6, were found by comparison analysis. According to their genetic relationship, the expression level of CsPAO gene in root was higher than that in stem. CsPAO gene expression in leaves and cotyledons was also induced by exogenous polyamines. According to its expression pattern, CsPAO4 gene may be involved in polyamine terminal catabolism and other CsPAO genes may be involved in polyamine response metabolism. Meanwhile, overexpression of CsPAO3 gene in tobacco can significantly increase Put content in transgenic tobacco. In addition, CsPAO gene was induced by ABA, low temperature, salt injury and osmotic stress. Analysis of the promoter sequence of CsPAO gene found that there were 203 cis-acting elements related to hormone and stress response. In order to elucidate the function of PAO gene, it may be involved in hormone response and stress stress response. The function of CsPAO4 in polyamine catabolism and stress response was analyzed by genetic transformation and biochemistry. The results showed that CsPAO4 could catalyze Spd and Spm and produce diaminopropane diapus, which indicated that the protein could participate in the end catabolism of polyamine. Overexpression of CsPAO4 gene in tobacco showed that the PAO enzyme activity of transgenic plants was significantly higher than that of wild-type plants. However, the contents of Spd and Spm decreased significantly, while the contents of Dap and H 2O 2 increased significantly. Transgenic tobacco under salt stress had faster seed germination rate and higher germination rate than wild type tobacco. The vegetative growth and root elongation of transgenic plants were significantly inhibited under salt stress. At the same time, the transgenic plants accumulated more H _ 2O _ 2 and had obvious programmed cell death (PCD) phenomenon. The exogenous hydrogen peroxide scavenger (CAT) could restore the root growth and vegetative growth of transgenic plants to some extent. Exogenous Spm treatment inhibited root growth of transgenic seedlings.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S666.4

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本文編號：1549426