本文關(guān)鍵詞： 大麥黃矮病毒GAV 華山新麥草 抗病性 遺傳多樣性 侵染性cDNA克隆　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDVs)是黃癥病毒科(Luteoviridae)多種病毒的統(tǒng)稱,僅由麥蚜以持久、循回、非增殖方式傳播。大麥黃矮病毒GAV(BYDV-GAV)為我國特有的一種大麥黃矮病毒,近年來已經(jīng)成為我國小麥黃矮病的主要病原,在小麥生產(chǎn)上造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。培育和種植抗病品種是防治小麥黃矮病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施,但是目前大面積推廣應(yīng)用的小麥品種大多對小麥黃矮病缺乏抗性,抗黃矮病小麥品種數(shù)量較少,抗病基因來源也較為單一,挖掘新的抗性資源是防治小麥黃矮病研究中亟待解決的重大問題。與此同時,對于BYDV-GAV群體遺傳結(jié)構(gòu)、病毒基因功能、分子致病機(jī)制等方面的研究也還較少。因此,本研究針對BYDV-GAV引起的小麥黃矮病,分別從寄主抗性和病原致病性兩個方面進(jìn)行了研究,主要結(jié)果如下:1.通過室內(nèi)蚜蟲接種,明確了BYDV-GAV能夠侵染我國特有的小麥野生近緣植物—華山新麥草(Psathyrostachys huashanica),并且病毒能夠通過無毒蚜蟲由華山新麥草回傳至健康小麥。華山新麥草接種BYDV-GAV后,利用RT-PCR和TAS-ELISA方法分別對接種葉和非接種葉定期進(jìn)行病毒檢測,結(jié)果表明BYDV-GAV在華山新麥草接種葉內(nèi)增殖緩慢,病毒含量極低,且系統(tǒng)運(yùn)動受到抑制,說明華山新麥草對BYDV-GAV具有高度抗性。對31份小麥-華山新麥草衍生系對BYDV-GAV的抗性進(jìn)行了鑒定,室內(nèi)抗病性鑒定和連續(xù)三年的田間抗病性鑒定結(jié)果表明,小麥-華山新麥草衍生系H9020、H9020-1-6-8-3、H9020-17-25-6-4、H9014-27-1-1-13-5-5、H9020-17-5和H9014-157-2-15-3共6個材料室內(nèi)接種BYDV-GAV后21 d病毒含量相對于衍生系所用的母本材料普通小麥7182明顯降低,H9020、H9020-1-6-8-3、H9020-17-25-6-4和H9015-17-4-4共4個材料田間接種BYDV-GAV后相對于普通小麥7182,癥狀明顯減輕,田間接種病毒對千粒重的影響也較小,表明部分小麥-華山新麥草衍生系對BYDV-GAV有一定抗性,華山新麥草對BYDV-GAV的抗性具有潛力應(yīng)用到小麥遺傳育種工作之中。2.采用RT-PCR分段擴(kuò)增和cDNA的RACE擴(kuò)增技術(shù),構(gòu)建了BYDV-GAV全基因組擴(kuò)增體系,測定了我國西北冬麥區(qū)5個BYDV-GAV小麥分離物的全基因組序列,分別為GAV-AK2(KF523378)、GAV-WN5(KF523379)、GAV-YL4(KF523380)、GAV-FF1(KF523381)和GAV-TS1(KF523382),并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的全部9個BYDV-GAV分離物的全基因組序列進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明BYDV-GAV的基因組序列較為保守,基因組核酸序列一致性高達(dá)97.0%-99.7%,在基因組內(nèi)部各個ORF間,ORF1變異最大,ORF4最為保守;基于全基因組序列和RdRp基因(ORF1+2)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示BYDV-GAV種內(nèi)分為2個類群,但與其地理分布沒有相關(guān)性,基于RTP基因(ORF3/4+5)、P6基因(ORF6)、P3a基因(ORF3a)的系統(tǒng)發(fā)育分析則未見存在種內(nèi)分化;BYDV-GAV各ORF的核酸變異對其蛋白序列的影響較小,目前病毒種群在進(jìn)化中處于負(fù)向選擇壓力下,種群遺傳結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定,種群規(guī)模處于擴(kuò)張階段;BYDV-GAV種群內(nèi)部存在著重組現(xiàn)象,檢測到GAV-05WN7和GAV-WN5兩個分離物可能均由GAV-04FX1和GAV-38W重組而來。3.應(yīng)用重疊延伸PCR和多片段同源重組技術(shù)得到了BYDV-GAV楊凌分離物(GAV-YL4)的全長cDNA,在其3’末端融合了具有自剪切活性的HDV-RZ元件,構(gòu)建了CaMV 35S啟動子介導(dǎo)的侵染性克隆載體pCass-GAV、pCass-GAV-RZ和pCass-HH-G-RZ,構(gòu)建了玉米泛素啟動子介導(dǎo)的pTCK-GAV-RZ和水稻蔗糖合酶1啟動子介導(dǎo)的pRSS-GAV-RZ。利用農(nóng)桿菌GV3101浸潤接種本氏煙(Nicotiana benthamiana),pCass-GAV-RZ和pCass-HH-G-RZ成功在接種葉轉(zhuǎn)錄出能進(jìn)行自我復(fù)制的病毒基因組RNA,并檢測到了病毒蛋白的表達(dá),但是子代病毒不能系統(tǒng)運(yùn)動。在本氏煙上研究發(fā)現(xiàn),BYDV-GAV基因組RNA 3’末端冗余序列能嚴(yán)重干擾病毒基因組RNA的復(fù)制或蛋白表達(dá),但5’末端少量的冗余堿基和5’帽子結(jié)構(gòu)對病毒RNA復(fù)制和蛋白表達(dá)未見明顯影響。利用農(nóng)桿菌LBA4404浸潤接種小麥、燕麥,pTCK-GAV-RZ和pRSS-GAV-RZ均能在接種葉轉(zhuǎn)錄出少量的病毒基因組RNA,并能檢測到病毒復(fù)制,但子代病毒仍然缺乏系統(tǒng)運(yùn)動能力。為了提高農(nóng)桿菌在單子葉植株上的侵染效率,嘗試了不同寄主(小麥、燕麥、水稻)、不同農(nóng)桿菌菌株(LBA4404、GV3101、AGL1、C58C1)、不同啟動子(玉米泛素啟動子、RSS1啟動子)、不同接種方式(農(nóng)桿菌浸潤接種、農(nóng)桿菌真空滲透接種、農(nóng)桿菌針刺接種、基因槍接種),但接種效果未見明顯改善。
[Abstract]:Barley yellow dwarf virus ( BYDV - GAV ) is the main pathogen of wheat yellow dwarf disease in China . The results show that BYDV - GAV is the main pathogen of wheat yellow dwarf disease in China . The whole genome sequence of 5 BYDV - GAV wheat isolates in Northwest China was determined by sequence analysis of GAV - AK2 ( KF523378 , KF523379 , KF523379 ) , GAV - YL4 ( KF523380 ) , GAV - FF1 ( KF523381 ) and GAV - 1 ( KF523382 ) . Different promoters ( maize ubiquitin promoter , Rss1 promoter ) , different inoculation methods ( Agrobacterium infiltration inoculation , Agrobacterium vacuum infiltration inoculation , Agrobacterium needle inoculation , gene gun inoculation ) , but the inoculation effect was not improved significantly .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.12
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本文編號：1514793