本文關(guān)鍵詞： 豬傳染性胃腸炎病毒 豬空腸上皮細(xì)胞 微絲骨架 cofilin 表皮生長(zhǎng)因子受體　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起仔豬嘔吐、腹瀉、脫水、腸絨毛萎縮,高死亡率為特征的高度接觸傳染性疾病,兩周齡以下的仔豬感染死亡率達(dá)100%,成年豬帶毒不發(fā)病,但是生長(zhǎng)緩慢,不斷排毒,免疫力低下,會(huì)繼發(fā)感染其它病原,該病給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。TGEV主要感染腸上皮細(xì)胞,但是其入侵機(jī)制還不清楚,細(xì)胞微絲骨架在介導(dǎo)病毒入侵過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,本實(shí)驗(yàn)之前研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染早期能夠引起腸上皮細(xì)胞微絲骨架的大量重排,但對(duì)其具體調(diào)控機(jī)制還不清楚。病毒入侵宿主細(xì)胞的第一步是同細(xì)胞膜表面受體結(jié)合,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)病毒入侵宿主細(xì)胞可能需要多個(gè)受體的協(xié)同。本研究以豬腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)為感染模型,探索TGEV調(diào)控微絲骨架重排的機(jī)制以及TGEV入侵新受體,為防控TGEV提供一定的理論依據(jù),本研究?jī)?nèi)容分為以下四個(gè)部分:1、TGEV SHXB毒株全基因組測(cè)序分析TGEV SHXB毒株分自中國(guó)上海,為了進(jìn)一步了解其遺傳進(jìn)化信息,對(duì)其全基因組序列進(jìn)行測(cè)序,將其序列同GenBank中已經(jīng)收錄的毒株序列進(jìn)行了比對(duì),比對(duì)結(jié)果顯示在5'和3'非編碼翻譯區(qū),非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1,ORF3和ORF7,結(jié)構(gòu)蛋白E蛋白,M蛋白和N蛋白的基因組均沒(méi)有外源插入或缺失;同其它毒株共有的現(xiàn)象是S基因第655位核苷酸都是鳥(niǎo)嘌呤(G ),第1753位核苷酸由胸腺嘧啶(T)突變成烏嘌呤(G ),造成第585位置絲氨酸突變成丙氨酸,該位置是S蛋白A, B抗原位點(diǎn);除了 purdue強(qiáng)毒株(Virulent Purdue)以外所有purdue毒株在第核苷酸1123-1128處存在6個(gè)核苷酸的缺失;進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)SHXB毒株同purdue毒株進(jìn)化上很靠近,同Miller毒株和豬呼吸道病毒PRCV-ISU-1毒株來(lái)源于同一祖先。2、TGEV感染早期引起IPEC-J2細(xì)胞微絲骨架的重排細(xì)胞的形狀、運(yùn)動(dòng)、吞噬、細(xì)胞器以及細(xì)胞間的交流都需要微絲骨架的參與。已經(jīng)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)許多病毒感染引起微絲的重排,微絲在介導(dǎo)病毒入侵和內(nèi)化過(guò)程中起著重要的作用。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TGEV (MOI = 2)感染引起微絲重排,細(xì)胞皮質(zhì)層微絲重排,皮質(zhì)層微絲的變化使細(xì)胞膜表面形成絲狀偽足,層狀偽足,片狀偽足,電鏡觀察發(fā)現(xiàn)微絲圍繞在病毒周?chē)?共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)病毒能夠同微絲共定位,利用微絲骨架蛋白抑制劑處理細(xì)胞能夠顯著的抑制TGEV的入侵(p 0.01),表明TGEV入侵早期能夠調(diào)控宿主細(xì)胞微絲骨架的排列,同時(shí)微絲骨架蛋白在TGEV入侵過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。cofilin是一種微絲解聚調(diào)控因子家族成員,其在調(diào)控微絲骨架蛋白解聚過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,本研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染早期能夠引起cofilin磷酸化水平上升,過(guò)表達(dá),干擾以及定點(diǎn)突變cofilin顯著抑制TGEV的入侵(p 0.01 ),干擾cofilin能夠顯著的抑制TGEV對(duì)微絲骨架的破壞,表明TGEV感染早期通過(guò)cofilin來(lái)調(diào)控微絲骨架。3、TGEV引起IPEC-2細(xì)胞微絲骨架重排機(jī)制的研究TGEV感染早期引起IPEC-J2細(xì)胞皮質(zhì)層微絲骨架重排,細(xì)胞應(yīng)力纖維絲消失,微絲骨架蛋白參與TGEV早期入侵的調(diào)控,微絲解聚因子cofilin在該過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。我們進(jìn)一步探索了 TGEV感染早期對(duì)cofilin的調(diào)控機(jī)制,定點(diǎn)突變Rho-GTPases家族顯著的抑制TGEV的入侵(p 0.05 ),Racl和Cdc42參與了對(duì)cofilin的早期調(diào)控;Rho-GTPases家族上游調(diào)控激酶PI3K抑制劑顯著抑制TGEV的入侵(P0.01 ),PI3K參與對(duì)cofilin的早期調(diào)控;表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是酪氨酸家族(RTK)成員之一,本研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染早期能夠激活細(xì)胞膜表面EGFR,同EGFR共定位,抑制EGFR的活性能顯著的抑制TGEV的入侵(p 0.01)和下游信號(hào)通路的激活,表明EGFR參與了 TGEV的入侵和cofilin的調(diào)控;脂筏(LipidRaft)主要由鞘磷脂和膽固醇組成,通過(guò)脂筏抑制劑去除細(xì)胞膜表面脂筏能夠顯著的抑制TGEV的黏附和入侵(p 0.01),TGEV感染早期促使脂筏的簇集,脂筏聚集在EGFR周?chē)?去除脂筏能夠顯著的抑制TGEV對(duì)EGFR和下游信號(hào)通路的激活,表明脂筏參與了 TGEV早期對(duì)cofilin和微絲骨架的調(diào)控。結(jié)果表明TGEV感染早期通過(guò)EGFR-PI3K-Racl/Cdc42-LIMK信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)cofilin,進(jìn)而對(duì)微絲骨架進(jìn)行調(diào)控,促進(jìn)病毒的入侵。4、EGFR介導(dǎo)TGEV入胞機(jī)制的研究TGEV感染早期通過(guò)EGFR-PI3K-Racl/Cdc42-LIMK信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)cofilin,對(duì)微絲骨架進(jìn)行調(diào)控,介導(dǎo)病毒的入侵。氨肽酶N(APN)是TGEV已知的一個(gè)受體,本章進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)干擾APN和EGFR能更顯著的抑制TGEV的入侵(p 0.01),EGFR的受體結(jié)合域1蛋白同TGEV作用后能夠顯著抑制TGEV入侵(p 0.05),TGEV的S1蛋白能夠同EGFR胞外區(qū)受體結(jié)合域1 ( Receptorl )互作;TGEV感染早期能夠促使APN和EGFR簇集,EGFR下游PI3K/AKT和ERK1/2信號(hào)通路參與了TGEV內(nèi)吞的調(diào)控;干擾APN受體能夠顯著的抑制TGEV對(duì)EGFR的激活,APN對(duì)EGFR下游內(nèi)吞信號(hào)的刺激起到協(xié)同作用;干擾小窩蛋白和網(wǎng)格蛋白都能顯著的抑制TGEV的入侵(p 0.01),說(shuō)明TGEV能通過(guò)小窩蛋白和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑內(nèi)陷到胞質(zhì);正常的細(xì)胞中有大量的EGFR存在細(xì)胞膜上,TGEV感染早期能夠引起大量的EGFR內(nèi)陷,干擾網(wǎng)格蛋白抑制EGFR的內(nèi)陷,證明TGEV同EGFR結(jié)合后通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入胞質(zhì)。結(jié)果表明:EGFR是TGEV入侵的另外一個(gè)受體,同APN.起著協(xié)同作用。
[Abstract]:In order to further understand its genetic evolution information , the whole genome sequence of TGEV infected host cells was identified as guanine ( G ) , but its invasion mechanism was not clear . The results showed that the genome sequence of TGEV infected host cells was guanine ( G ) , and the 1753 nucleotide was mutated to guanine ( G ) by thymidine ( T ) . In addition to purdue virulent strain ( Virulent Purdue ) , all purdue strains had 6 nucleotides deletion at nucleotide 1123 - 1128 . It was found that SHXB strain was closely related to purdue strain . It was found that TGEV infection can inhibit the invasion of TGEV ( p 0.01 ) . It is suggested that TGEV can inhibit the invasion of TGEV ( p 0.01 ) . The effect of TGEV on the activation of EGFR and EGFR in early stage of TGEV infection can significantly inhibit TGEV invasion ( p 0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.651

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 葛晨霞;王龍濤;馬磊;胡桂學(xué);;豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2010年12期

2 王劭;朱小麗;朱曉琳;陳少鶯;林鋒強(qiáng);陳仕龍;程曉霞;李兆龍;江斌;;豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)福建分離株核衣殼蛋白基因(N)的克隆與表達(dá)分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2013年01期

3 房紅瑩;竇守強(qiáng);羅滿林;;豬呼吸道冠狀病毒研究進(jìn)展[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘;2007年06期

4 唐芳;何孔旺;侯繼波;姜平;;豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)S蛋白5'端基因重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫特性[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2009年01期

5 房紅瑩;羅滿林;;豬傳染性胃腸炎病毒反向遺傳研究進(jìn)展[J];畜牧與獸醫(yī);2008年04期

6 ;Complete Genomic Sequence of Transmissible Gastroenteritis Virus TS and 3' End Sequence Characterization Following Cell Culture[J];Virologica Sinica;2010年03期

7 李建強(qiáng);柳紀(jì)省;程杰;蘭喜;殷相平;李寶玉;李學(xué)瑞;楊彬;婁忠子;吳潤(rùn);;豬源冠狀病毒TGEV中國(guó)分離株纖突蛋白生物信息學(xué)分析[J];生物技術(shù)通報(bào);2009年04期

8 黃小波;鄧飛;曹三杰;文心田;楊恒;李春松;張?chǎng)雾?張亮;;傳染性胃腸炎病毒(TGEV)雙啟動(dòng)子真核表達(dá)載體pVAXD-N/S的構(gòu)建與鑒定[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2012年10期

9 ;Biological Characteristics and Etiological Significance of Porcine Respiratory Coronavirus(PRCV)[J];Journal of Northeast Agricultural University(English Edition);2009年02期

10 程杰,柳紀(jì)省,吳潤(rùn),殷相平;豬傳染性胃腸炎病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;2003年12期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 鄒勇;周燕;王建超;華平;何錫忠;蘇萬(wàn)國(guó);唐永蘭;錢(qián)永清;;應(yīng)用微載體技術(shù)生產(chǎn)TGEV試驗(yàn)研究[A];第六屆全國(guó)會(huì)員代表大學(xué)暨第11次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下）[C];2005年

2 鄒勇;周燕;王建超;華平;何錫忠;蘇萬(wàn)國(guó);唐永蘭;錢(qián)永清;;應(yīng)用微載體技術(shù)生產(chǎn)TGEV試驗(yàn)研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第六屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第11次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2005年

3 ;Inhibition of porcine Transmissible gastroenteritis virus (TGEV) replication in mini-pigs by shRNA[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國(guó)免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

4 楊百亮;馮力;趙翠萍;孫東波;張建斌;;抗豬傳染性胃腸炎病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國(guó)免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第七次研討會(huì)論文集[C];2008年

5 周燕;王建超;華平;鄒勇;譚文松;;豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)在ST細(xì)胞中的增殖規(guī)律[A];第一屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集(下)[C];2004年

6 俞伏松;王劭;陳仕龍;程曉霞;黃梅清;江斌;邵良平;陳少鶯;;豬傳染性胃腸炎病毒福建株的分離與鑒定[A];2012年福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2012年

7 李霞;張春紅;趙亞華;張建峰;;TGEV和PEDV多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及其細(xì)胞分離培養(yǎng)研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

8 黃小波;曹三杰;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)基因芯片的初步構(gòu)建[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第六屆理事會(huì)第二次會(huì)議暨教學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第六屆代表大會(huì)論文集[C];2006年

9 黃小波;曹三杰;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒檢測(cè)基因芯片的初步構(gòu)建[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2006學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2006年

10 李娜;黃小波;曹三杰;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒重組N蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 胡唯偉;TGEV利用表皮生長(zhǎng)因子受體調(diào)控腸上皮細(xì)胞微絲骨架及其入胞機(jī)制的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 馬瑞麗;豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

3 胡曉亮;豬傳染性胃腸炎病毒HX株的分離與鑒定及其PL蛋白對(duì)抗IFN-β的分子機(jī)制[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 宋祥軍;microRNA在TGEV感染PK-15細(xì)胞過(guò)程中的作用與調(diào)控機(jī)制[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

5 王雪飛;中藥復(fù)方體外抗TGEV誘導(dǎo)豬小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 郭錦s，

本文編號(hào)：1487325