本文關(guān)鍵詞： 豬傳染性胃腸炎病毒 豬空腸上皮細胞 微絲骨架 cofilin 表皮生長因子受體　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起仔豬嘔吐、腹瀉、脫水、腸絨毛萎縮,高死亡率為特征的高度接觸傳染性疾病,兩周齡以下的仔豬感染死亡率達100%,成年豬帶毒不發(fā)病,但是生長緩慢,不斷排毒,免疫力低下,會繼發(fā)感染其它病原,該病給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失。TGEV主要感染腸上皮細胞,但是其入侵機制還不清楚,細胞微絲骨架在介導(dǎo)病毒入侵過程中發(fā)揮著重要的作用,本實驗之前研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染早期能夠引起腸上皮細胞微絲骨架的大量重排,但對其具體調(diào)控機制還不清楚。病毒入侵宿主細胞的第一步是同細胞膜表面受體結(jié)合,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)病毒入侵宿主細胞可能需要多個受體的協(xié)同。本研究以豬腸上皮細胞(IPEC-J2)為感染模型,探索TGEV調(diào)控微絲骨架重排的機制以及TGEV入侵新受體,為防控TGEV提供一定的理論依據(jù),本研究內(nèi)容分為以下四個部分:1、TGEV SHXB毒株全基因組測序分析TGEV SHXB毒株分自中國上海,為了進一步了解其遺傳進化信息,對其全基因組序列進行測序,將其序列同GenBank中已經(jīng)收錄的毒株序列進行了比對,比對結(jié)果顯示在5'和3'非編碼翻譯區(qū),非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1,ORF3和ORF7,結(jié)構(gòu)蛋白E蛋白,M蛋白和N蛋白的基因組均沒有外源插入或缺失;同其它毒株共有的現(xiàn)象是S基因第655位核苷酸都是鳥嘌呤(G ),第1753位核苷酸由胸腺嘧啶(T)突變成烏嘌呤(G ),造成第585位置絲氨酸突變成丙氨酸,該位置是S蛋白A, B抗原位點;除了 purdue強毒株(Virulent Purdue)以外所有purdue毒株在第核苷酸1123-1128處存在6個核苷酸的缺失;進化樹分析發(fā)現(xiàn)SHXB毒株同purdue毒株進化上很靠近,同Miller毒株和豬呼吸道病毒PRCV-ISU-1毒株來源于同一祖先。2、TGEV感染早期引起IPEC-J2細胞微絲骨架的重排細胞的形狀、運動、吞噬、細胞器以及細胞間的交流都需要微絲骨架的參與。已經(jīng)有報道發(fā)現(xiàn)許多病毒感染引起微絲的重排,微絲在介導(dǎo)病毒入侵和內(nèi)化過程中起著重要的作用。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TGEV (MOI = 2)感染引起微絲重排,細胞皮質(zhì)層微絲重排,皮質(zhì)層微絲的變化使細胞膜表面形成絲狀偽足,層狀偽足,片狀偽足,電鏡觀察發(fā)現(xiàn)微絲圍繞在病毒周圍,共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)病毒能夠同微絲共定位,利用微絲骨架蛋白抑制劑處理細胞能夠顯著的抑制TGEV的入侵(p 0.01),表明TGEV入侵早期能夠調(diào)控宿主細胞微絲骨架的排列,同時微絲骨架蛋白在TGEV入侵過程中發(fā)揮著重要的作用。cofilin是一種微絲解聚調(diào)控因子家族成員,其在調(diào)控微絲骨架蛋白解聚過程中發(fā)揮著重要的作用,本研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染早期能夠引起cofilin磷酸化水平上升,過表達,干擾以及定點突變cofilin顯著抑制TGEV的入侵(p 0.01 ),干擾cofilin能夠顯著的抑制TGEV對微絲骨架的破壞,表明TGEV感染早期通過cofilin來調(diào)控微絲骨架。3、TGEV引起IPEC-2細胞微絲骨架重排機制的研究TGEV感染早期引起IPEC-J2細胞皮質(zhì)層微絲骨架重排,細胞應(yīng)力纖維絲消失,微絲骨架蛋白參與TGEV早期入侵的調(diào)控,微絲解聚因子cofilin在該過程中發(fā)揮著重要的作用。我們進一步探索了 TGEV感染早期對cofilin的調(diào)控機制,定點突變Rho-GTPases家族顯著的抑制TGEV的入侵(p 0.05 ),Racl和Cdc42參與了對cofilin的早期調(diào)控;Rho-GTPases家族上游調(diào)控激酶PI3K抑制劑顯著抑制TGEV的入侵(P0.01 ),PI3K參與對cofilin的早期調(diào)控;表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是酪氨酸家族(RTK)成員之一,本研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染早期能夠激活細胞膜表面EGFR,同EGFR共定位,抑制EGFR的活性能顯著的抑制TGEV的入侵(p 0.01)和下游信號通路的激活,表明EGFR參與了 TGEV的入侵和cofilin的調(diào)控;脂筏(LipidRaft)主要由鞘磷脂和膽固醇組成,通過脂筏抑制劑去除細胞膜表面脂筏能夠顯著的抑制TGEV的黏附和入侵(p 0.01),TGEV感染早期促使脂筏的簇集,脂筏聚集在EGFR周圍,去除脂筏能夠顯著的抑制TGEV對EGFR和下游信號通路的激活,表明脂筏參與了 TGEV早期對cofilin和微絲骨架的調(diào)控。結(jié)果表明TGEV感染早期通過EGFR-PI3K-Racl/Cdc42-LIMK信號通路來調(diào)節(jié)cofilin,進而對微絲骨架進行調(diào)控,促進病毒的入侵。4、EGFR介導(dǎo)TGEV入胞機制的研究TGEV感染早期通過EGFR-PI3K-Racl/Cdc42-LIMK信號通路來調(diào)節(jié)cofilin,對微絲骨架進行調(diào)控,介導(dǎo)病毒的入侵。氨肽酶N(APN)是TGEV已知的一個受體,本章進一步研究發(fā)現(xiàn)同時干擾APN和EGFR能更顯著的抑制TGEV的入侵(p 0.01),EGFR的受體結(jié)合域1蛋白同TGEV作用后能夠顯著抑制TGEV入侵(p 0.05),TGEV的S1蛋白能夠同EGFR胞外區(qū)受體結(jié)合域1 ( Receptorl )互作;TGEV感染早期能夠促使APN和EGFR簇集,EGFR下游PI3K/AKT和ERK1/2信號通路參與了TGEV內(nèi)吞的調(diào)控;干擾APN受體能夠顯著的抑制TGEV對EGFR的激活,APN對EGFR下游內(nèi)吞信號的刺激起到協(xié)同作用;干擾小窩蛋白和網(wǎng)格蛋白都能顯著的抑制TGEV的入侵(p 0.01),說明TGEV能通過小窩蛋白和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑內(nèi)陷到胞質(zhì);正常的細胞中有大量的EGFR存在細胞膜上,TGEV感染早期能夠引起大量的EGFR內(nèi)陷,干擾網(wǎng)格蛋白抑制EGFR的內(nèi)陷,證明TGEV同EGFR結(jié)合后通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進入胞質(zhì)。結(jié)果表明:EGFR是TGEV入侵的另外一個受體,同APN.起著協(xié)同作用。
[Abstract]:In order to further understand its genetic evolution information , the whole genome sequence of TGEV infected host cells was identified as guanine ( G ) , but its invasion mechanism was not clear . The results showed that the genome sequence of TGEV infected host cells was guanine ( G ) , and the 1753 nucleotide was mutated to guanine ( G ) by thymidine ( T ) . In addition to purdue virulent strain ( Virulent Purdue ) , all purdue strains had 6 nucleotides deletion at nucleotide 1123 - 1128 . It was found that SHXB strain was closely related to purdue strain . It was found that TGEV infection can inhibit the invasion of TGEV ( p 0.01 ) . It is suggested that TGEV can inhibit the invasion of TGEV ( p 0.01 ) . The effect of TGEV on the activation of EGFR and EGFR in early stage of TGEV infection can significantly inhibit TGEV invasion ( p 0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651

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