本文關(guān)鍵詞： 豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征 非結(jié)構(gòu)蛋白 免標(biāo)記蛋白組學(xué) 互作 抑制劑實(shí)驗(yàn)　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒(PRRSV)是嚴(yán)重危害我國(guó)乃至全球養(yǎng)豬業(yè)的一種單股正鏈RNA病毒,它不僅在世界范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,也帶來(lái)了食品安全方面的諸多問(wèn)題。由于RNA病毒的高變異性,市面上現(xiàn)有疫苗存在一定程度的局限性,因此高效穩(wěn)定的疫苗和抗病毒策略的研發(fā)顯得愈發(fā)重要。目前,盡管已對(duì)PRRSV進(jìn)行了大量深入的研究報(bào)道,我們對(duì)一些病毒蛋白,例如非結(jié)構(gòu)蛋白7(NSP7)和非結(jié)構(gòu)蛋白12(NSP12)的結(jié)構(gòu)和功能依然所知甚少。文獻(xiàn)顯示這些蛋白與病毒生長(zhǎng)過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制進(jìn)程相關(guān),因此,了解他們?cè)谄渲邪l(fā)揮的功能是我們亟待解決的問(wèn)題。已有關(guān)于PRRSV的N,NSP1β,NSP2等蛋白及病毒粒子與宿主細(xì)胞蛋白的互作關(guān)系的研究報(bào)道,但NSP12和NSP7與宿主蛋白的互作還鮮有深入研究。本研究首先對(duì)病毒蛋白在感染細(xì)胞中的時(shí)空表達(dá)情況進(jìn)行了研究。用PRRSV感染Marc-145細(xì)胞48h后,細(xì)胞感染率達(dá)到峰值。PRRSV感染PAM細(xì)胞12小時(shí)即能檢出NSP12,感染Marc-145細(xì)胞24h后,NSP12蛋白的表達(dá)量達(dá)到峰值,說(shuō)明在病毒侵染細(xì)胞過(guò)程中,非結(jié)構(gòu)蛋白作為病毒生長(zhǎng)周期不可或缺的一部分,會(huì)在感染初期優(yōu)先表達(dá),發(fā)揮功能。其次,我們對(duì)NSP12和NSP7在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行純化,通過(guò)條件優(yōu)化得到純度滿意的NSP7蛋白,而NSP12蛋白呈包涵體狀,需進(jìn)一步摸索優(yōu)化條件。得到的純化蛋白為其后續(xù)功能,結(jié)構(gòu)方面研究奠定必要基礎(chǔ)。接著,經(jīng)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析鑒定出了12種與NSP7結(jié)合的宿主細(xì)胞蛋白,我們從中選取過(guò)氧化物氧化還原酶4(PRDX4)進(jìn)行深入研究。用sh RNA沉默PRDX4基因表達(dá)后,PRRSV病毒滴度顯著降低。對(duì)病毒蛋白與宿主細(xì)胞互作圖譜的分析表明,病毒蛋白可以與大量宿主蛋白形成復(fù)雜的互作關(guān)系,并且參與到病毒和宿主的生物學(xué)進(jìn)程中。最后,通過(guò)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析,我們鑒定出112種與NSP12有潛在互作關(guān)系的細(xì)胞蛋白,并繪制出它們間的互作網(wǎng)絡(luò)圖譜。這些蛋白主要為核酸結(jié)合蛋白或分子伴侶,它們參與RNA轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白合成、細(xì)胞組成裝配等進(jìn)程。IPA軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明,NSP12的表達(dá)與真核蛋白合成相關(guān)的真核起始因子-2(e IF2)信號(hào)通路顯著相關(guān)。在這些蛋白中,我們挑選HSP70進(jìn)行進(jìn)一步分析。添加針對(duì)HSP70功能的小分子抑制劑,會(huì)顯著降低病毒滴度和m RNA的合成水平。我們的數(shù)據(jù)顯示,在藥物安全范圍內(nèi),隨著HSP70抑制劑濃度的增加,NSP12-EGFP蛋白量相比于對(duì)照組明顯降低,這表明,NSP12會(huì)招募一些宿主細(xì)胞蛋白例如HSP70來(lái)維持其自身穩(wěn)定表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制。在蛋白酶體抑制劑MG132存在情況下,NSP12-EGFP蛋白水平得到一定程度的恢復(fù),進(jìn)一步證實(shí)了NSP12-EGFP蛋白量降低的確是由于HSP70功能受到抑制所導(dǎo)致,說(shuō)明NSP12與HSP70的互作關(guān)系在一定程度上起著阻止蛋白降解的作用。本論文的研究結(jié)果為在宿主蛋白中尋找藥物治療靶位點(diǎn)的新型治療方法和抗病毒方案提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1475336